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《湖南大学》 2011年
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DNA和蛋白质生物标志物光学分析新方法

王红旗  
【摘要】:生物大分子是构成生命的基础物质,主要包括蛋白质、核酸、脂质和糖四大类,其中蛋白质和核酸是生命科学中最重要的两类生物大分子。单核苷酸多态性(SNPs)是一种常见且可稳定遗传的基因变异,能够诱导产生许多遗传疾病,而人体内各种蛋白质含量的变化直接反映了人体的新陈代谢情况,这些已成为疾病诊断的主要依据。因此,针对生物体内的标志性生物大分子蛋白质和核酸的检测、分析在生命科学和生物医学研究以及疾病的临床诊断领域具有十分重要的科学意义。许多的早期诊断都是基于荧光光谱、荧光各向异性、荧光共振能量转移以及表面等离子共振等的测量实现的。尽管以上这些技术非常重要,发展高特异性、高灵敏度且稳健、易操作、低成本的蛋白质和核酸分析方法与技术一直是分析化学研究的重要内容,是分析科学家们不懈追求的奋斗目标。基于光谱或者发光的检测技术由于具有灵敏度高、操作简便、检测成本低、所需仪器简单以及易于实现微型化等特点,使得以光化学检测为基础的生物分析技术具有极其广阔的应用前景。为此,本研究论文我们发展了几种基于光化学的基因分型技术、DNA检测技术以及蛋白质分析方法: (1)建立了一种基于连接酶介导链置换放大—脱氧核酶催化均相免标记化学发光的基因分型新方法。该方法利用连接酶对错配的高特异性识别,仅将与目标基因完全互补的探针共价连接。在具有强链置换能力的聚合酶及切刻酶的共同作用下,该连接产物3’端的发夹结构自发启动聚合酶延伸反应,在近5’端获得完整的切刻酶识别位点,从而介导切刻酶切割、聚合酶延伸以及链置换释放的恒温链置换放大反应。被释放的第一级放大产物会与另一链置换放大反应模板杂交,引发第二级链置换放大反应,释放大量的血红素适配体。该适配体与血红素结合后,催化鲁米诺-双氧水反应而产生化学发光信号。据此判定目标基因与探针是否在多态性位点发生错配,从而可实现目标基因的基因型的鉴定。该方法采用具有很好的特异性,很高的灵敏度,使其检测限可达0.1fM,可直接应用与基因组的检测。同时还具有很高的信背比(150倍)与较宽的动态响应范围(1fM至1nM)。而且,该方法可完全在均相中实现,操作简便,易于自动化与高通量化,因此可望在基因组研究与分子诊断领域方面具有一定的应用前景。 (2)发展了一种基于高温连接酶检测反应介导的链置换放大—脱氧核酶催化化学发光的免标记基因分型新方法用于细胞色素C P4502D6*10的基因分型。该方法针利用高温连接酶对错配的高特异性识别,在进行退火连接-变性解链的热循环过程中,仅将3’端与目标基因完全互补的探针对共价连接,产生大量的连接产物。在具有强链置换能力的聚合酶及切刻酶的共同作用下,具有发夹结构的连接产物的3’端自发延伸,介导切刻酶切割、聚合酶延伸以及恒温链置换反应,进行第二步扩增,释放大量的血红素适配体。该适配体与血红素结合形成具有辣根过氧化酶催化活性的复合物,催化鲁米诺-双氧水反应产生化学发光信号,从而实现对目标基因的基因型的鉴定。该方法采用具有高忠实性的高温DNA连接酶进行等位基因的判别,保证了分型方法的高特异性。同时,由于引入了线性恒温链置换反应,进一步提高了方法的灵敏度,使其检测限可达0.1pM。由于结合血红素适配体的催化化学发光进行信号转换,该法获得了57倍的较高信背比,同时具有1pM至1nM的较宽动态响应范围。由于该方法可完全在均相中实现,重现性好,同时无需标记,成本低廉,又操作简便,易于自动化与高通量化,因此可望在药理基因组研究与分子诊断领域方面具有一定的应用前景。 (3)提出了一种基于连接酶链反应的通用PCR—生物编码色谱多位点同时检测的基因分型新方法。该方法针对目标DNA设计了一对等位特异性区分探针和条通用探针,具有高特异性识别能力的连接酶仅将与目标DNA完全互补的探针对共价连接。以此连接产物为扩增模版,加入荧光标记的通用引物进行PCR扩增,从而获得大量荧光标记的含有生物编码序列和完整限制性内切酶识别序列的扩增产物。经过限制性内切酶处理,将目标DNA的基因型链转化为预先设计的生物编码序列,再采用离子对反相高效液相色谱进行分离与同时检测。该技术显著地提高了目标DNA分子的检测灵敏度和准确性。已采用该新方法对两个位点的不同基因突变情况成功地进行了同时基因分型,检测下限为0.1fM。 (4)设计了一种基于循环酶切原理的光化学生物传感技术用于靶核酸的简单,灵敏与快速的分析与检测。该方法设计了一条3’端修饰有荧光基团和淬灭基团的双标探针。若靶核酸存在,该探针与其杂交形成完全匹配的双链,从而启动核酸外切酶Ⅲ介导的循环酶切过程,水解掉双链杂交体中的双标探针,促使荧光基团与淬灭基团分离,产生荧光信号,而未被水解的靶核酸继续参与下一个酶切循环,进而实现对靶核酸的循环放大检测。模拟靶序列实验证明,该方法还具有一定的碱基错配的区分能力。在50pM-750pM靶核酸浓度范围内,该方法具有较好的动态响应,检测下限为0.1pM。 (5)构建了一种基于巢式PCR—生物编码色谱的品系特异性转基因玉米多靶标同时检测新方法。该方法针对目标DNA设计了一对目标特异性探针,在目标基因存在的情况下,经第一阶段几个扩增循环产生少量PCR扩增产物;以第一阶段的PCR产物为扩增模板,加入荧光标记的通用引物进行第二阶段的通用PCR扩增,从而获得大量荧光标记的含有生物编码序列和完整限制性内切酶识别序列的扩增产物。经过限制性内切酶处理,将目标DNA的基因型链转化为预先设计的生物编码序列,再采用离子对反相高效液相色谱进行分离与同时检测。该技术显著地提高了目标DNA分子的检测灵敏度和准确性。已采用该新方法对四个模拟靶标序列成功地进行了同时检测分析,检测下限为0.01fM。 (6)开发了一种基于荧光保护分析原理的均相适配体传感技术用于蛋白的分析检测。该技术利用荧光素标记的适配体与其受体蛋白结合,抑制荧光素抗体诱导的荧光淬灭,从而实现对受体蛋白的定量检测。以免疫球蛋白IgE为模型蛋白的验证实验证明该方法具有较高的灵敏度;血清中共存蛋白的干扰实验,证明该方法也具有很好的抗干扰能力,即具有很高的特异性。采用不同的荧光标记基团以及相应的抗体,还可以利用该方法对多蛋白进行同时分析,实现高通量检测的目标。在0.1-50nM浓度范围内,该适配体传感器具有很好的动态响应,检测下限为0.1nM。由于采用均相策略,简单快捷,重现性好,成本低廉,又易于高通量化,因此该方法有望为蛋白的均相快速检测以及功能核酸研究提供一种高灵敏、高特异性的适配体传感技术。
【学位授予单位】:湖南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q503;O657.3

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【参考文献】
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