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拟南芥DHHC型锌指蛋白基因At5g04270分离鉴定与功能生化分析

向静  
【摘要】:植物株型的形成是一个受多种因素,如基因型、激素、环境和营养条件等影响的复杂生物学现象,而腋生器官的发生发育在此过程中起着非常重要的作用。在长日照条件下(16小时光照,8小时黑暗),以拟南芥隐花素突变体cry1cry2为研究背景构建了T-DNA激活标签突变体库,筛选得到与株型变化相关的突变体scc10-D,通过T-DNA激活标签插入位点的鉴定、T-DNA强启动子作用基因的克隆、重组、抗性筛选、遗传和生物信息学分析等研究,获得了以下主要研究结果: (1)以拟南芥隐花素突变体cry1cry2为背景,用激活标签技术构建了拟南芥的基因功能获得型T-DNA突变体库,获得了近2000个独立转化株系。通过抗性基因筛选和表型观察分析,在T1代转化植株中,共发现4个有显著的表型变化的株系,从中筛选得到一个与分枝相关的突变体scc10-D。采用IPCR等技术对拟南芥多分枝突变体scc10-D的插入位点进行分析鉴定,获得T-DNA在突变体cry1cry2基因组的插入位点是第5号染色体的90708核苷酸处。采用RT-PCR和实时定量PCR的方法对T-DNA基因组插入位点上游和下游6个侯选基因进行了mRNA转录表达水平的差异分析,结果发现在scc10-D多分枝突变体中,T-DNA的插入引起了DHHC型的锌指蛋白基因At5g04270的表达量上调,其余基因的表达量基本无明显上调变化。研究结果表明scc10-D突变体多分枝的表型由At5g04270基因表达量上调所致。 (2)克隆At5g04270并通过酶切连接的方法将其重组到过表达载体pEGAD,然后通过农杆菌GV3101浸花蕾的方法将(?)EGAD-At5g04270重组体通过转化整合到拟南芥野生型Col-4基因组,构建过量表达转基因植株35S::GFP-At5g04270。通过除草剂的连续三代筛选得到转基因植株的纯合体,结果发现该转基因植株分枝增加。同时,采用RT-PCR检测了转基因纯合体植株的mRNA水平,发现At5g04270基因的表达量上调,该结果进一步证实scc10-D突变体多分枝表型是由At5g04270基因表达量上调所致。采用三引物法对At5g04270基因T-DNA插入突变体(SALK006515)的DNA进行分子鉴定及纯合株系的筛选。采用RT-PCR的方法进行At5g04270转录mRNA表达分析,在SALK_006515的纯合突变体中基本上检测不到At5g04270基因的表达,结果表明我们筛选到了SALK_006515的纯合突变体。通过RT-PCR对拟南芥根、茎、莲座叶、茎生叶、花中分别提取At5g04270基因的mRNA转录表达的检测,At5g04270基因在各个不同器官中均有表达,在花和莲座叶中表达量较高,根、茎、茎出叶较低,莲座叶中表达量比花中高。 (3)利用拟南芥TAIR和NCBI网站提供的生物信息学数据对At5g04270的对该基因锌指结构域DHHC定点突变的At5g04270C105A进行了氨基酸修饰位点、信号肽序列、跨膜结构以及亲疏水性对比分析,预测结果发现At5g04270所编码的蛋白是一个膜蛋白,存在3个主要的跨膜结构域及一个次要的跨膜结构域和DHHC-CRD结构域,可能具有蛋白质酰基转移酶的活性。氨基酸C(半胱氨酸)是脂肪族含巯基的极性氨基酸,氨基酸A(丙氨酸)是脂肪族的非极性氨基酸。At5g04270的DHHC定点突变的DHHA后,由于氨基酸极性的改变,预测其可能改变了结构域与锌离子的结合能力,使其失去了蛋白质酰基转移酶的活性。 (4)采用搭桥PCR方法将At5g04270基因的DHHC结构域定点突变为DHHA,然后将At5g04270和发生定点突变的At5g04270C105A克隆到酵母的表达载体pYES260,然后将该重组载体转化到酵母蛋白酰基转移酶ARK1的突变体ark1,结果发现在30℃的条件下,通过载体上的GAL1强启动子在半乳糖的选择培养基中过表达At5g04270,能够使成ARK1的突变体ark1表型恢复为ARK1表型,而发生定点突变的At5g04270C105A在同等培养条件下却不能恢复其表型,该研究结果说明At5g04270具有蛋白质酰基转移酶活性,DHHC结构域是该酶的功能结构域。通过酶切连接技术成功构建了原核表达质粒pCold-At5g04270;通过Gateway技术成功构建了原核表达质粒pDEST17-At5g04270,将At5g04270克隆到原核表达载体pCold和pDEST17,为进一步研究At5g04270基因的功能提供基础。


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