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《湖南大学》 2014年
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核酸分子探针与生物传感新方法的研究

周殿明  
【摘要】:近年来,生物传感与生化分析新方法的研究进展,极大地推动了分析化学与生命科学的学科发展,在分析化学和生命科学的交叉领域,无论在科学研究方面还是实际应用都发挥着越来越重要的作用。核酸分子探针因其稳定,易于修饰,序列多变,识别多元化等优点在生物传感与生化分析的新方法建立方面得到了越来越多的重视。本论文致力于结合多种功能核酸分子探针,新兴纳米材料和光学检测技术建立多种生物传感和生化分析新方法用于microRNA表达水平的分析,尿嘧啶DNA糖基化酶和胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性检测,小分子及其受体蛋白的相互作用研究,以及革兰氏阴性细菌标识分子脂多糖的定量。本论文建立的分析方法均相操作简便,灵敏度高,特异性好,具体内容如下: MicroRNA是一类较短,长度在23个碱基左右的非蛋白质编码的RNA分子,在生物体内参与组建沉默复合物与目标mRNA杂交,通过抑制翻译或者降解目标分子的方式实现蛋白表达的调控和参与各种生物代谢。近年来研究发现microRNA表达水平的变化与癌症的种类,发展阶段甚至药物治疗效果都息息相关。本论文第2章发展了一种新的等温核酸扩增技术,该技术基于循环的酶切修复和聚合酶链置换延伸过程,实现了高灵敏的microRNA定量检测。酶切修复扩增(Enzymatic Repairing Amplification (ERA))反应首先通过聚合酶复制DNA模板,在复制过程中掺入损伤碱基,接下来损伤碱基的掺入引发修复酶的损伤碱基剪切修复反应,修复产生新的聚合酶延伸位点产生新一轮的复制反应。通过将待测目标microRNA作为引物,酶切修复扩增反应可以产生大量的报告核酸序列。报告核酸序列与内切酶IV介导的信号输出反应结合,实现了单步,闭管和实时的高灵敏高特异microRNA检测。本章发展的分析技术检测下限为0.1fM,同时具有非常好的特异性,能实现单碱基错配的良好区分。结果表明,该酶切修复扩增反应为有效的核酸扩增提供了新的范例,有望用于microRNA的表达水平分析和相关的治疗诊断应用。 尿嘧啶DNA糖基化酶(Uracil DNA Glycosylase, UDG)作为一种最重要的碱基切除修复蛋白,在保护基因组免受内源性DNA损伤和维持基因完整性方面起着非常重要的作用。因此,UDG活性的定量分析是生物分析领域的核心挑战,具有非常重要的意义。我们在第3章发展了一种新兴的生物传感器,该传感器通过吸附荧光基团标记的发夹形探针于氧化石墨烯表面构建均相分析检测平台用于灵敏的UDG活性分析。活性UDG能够切除发夹形探针的尿嘧啶碱基,产生脱碱基位点,该位点进一步水解断裂可以将荧光基团从氧化石墨烯表面释放,恢复荧光,从而为UDG活性定量分析提供了一个简便的分析方法。由于氧化石墨烯具有广泛高效的荧光猝灭性质,发夹形探针标记的荧光基团与氧化石墨烯之间可以发生荧光共振能量转移,产生极低的荧光背景,使得UDG活性分析具有较宽的动态响应范围,从0.0017U/mL到0.8U/mL和较低的检测限0.0008U/mL。结果表明,该方法为UDG活性分析和相关的生物学研究提供了一个简便,低耗,高灵敏和高选择性的均相检测平台。 实现小分子与蛋白质之间相互作用的定量分析是生物遗传学,分子诊断,药物筛选及基础研究等领域的核心挑战。第4章,我们通过生物分子构建了一部转录纳米机器,具体而言是模拟原核生物的转录行为,将转录酶、启动子、转录模板以及相关辅助因子结合信号发生机制组装成为新的体外转录纳米机器。该转录机器的正常运转可以不断产生荧光信号,但是目标蛋白质与启动子区标记的小分子的结合可引起机器的滞动,定量抑制该机器的RNA转录活性,降低和完全抑制荧光信号的释放。这一发现促使我们发展了一种新型均相无标记的分析方法用于研究小分子及其蛋白质受体之间的相互作用。同时,本章我们使用生物素、荧光素和叶酸三种小分子及其相应的抗体或者受体蛋白验证该方法的可行性和通用性。实验结果表明该方法的动态响应范围是0.5nM到64nM,检测下限为0.2nM。均相无标记荧光检测平台,使得该方法具有很多优点,比如灵敏度高、稳健、成本低、操作简便和易于实现自动化等,为发展均相蛋白质检测技术提供了新的思路和策略。 胸腺嘧啶DNA糖基化酶(Thymine DNA Glycosylase, TDG)作为一种碱基特异的糖基化酶,对于基因组的损伤修复和保持遗传信息的完整性都有着重要的作用。不仅如此,近年来发现TDG蛋白参与基因组的活性去甲基化过程,因而对于基因的表达调控也扮演着重要的角色。第5章基于外切酶循环剪切信号放大技术发展了一种新型的均相荧光检测方法用于TDG蛋白活性的定量分析。TDG识别发夹探针中的G:T错配结构,首先切除错配碱基对中的T碱基,从而先后激活了两个酶活性。两个酶共同作用将发夹形探针剪切成线性的模板,模板与信号探针杂交成为外切酶底物,外切酶循环剪切信号探针释放荧光信号,荧光信号的强度用于TDG活性的定量分析。实验结果表明酶浓度在0到0.17U/μμL范围内,荧光强度与TDG蛋白活性有良好的动态响应。由于外切酶辅助信号放大使得方法具有较高的灵敏度,实验测得方法的检测下限为0.00018U/μL。除了灵敏度高以外,该方法特异性好,稳健,经济,且操作简便。这些优点使得该方法有望用于TDG蛋白活性分析和相关的生物学功能研究。 脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性细菌的标志性分子,是革兰氏阴性细菌细胞壁外膜的主要组成成分,通常被称为细菌的内毒素。脂多糖在细菌感染时被大量释放到人体中可能引起人体免疫反应,先后导致感染性休克,器官衰竭,最终可能导致死亡。因此在医学领域,脂多糖的定量分析检测是生物分析工作者的核心挑战,具有重要的理论和现实意义。第6章我们提出了一种检测脂多糖的新方法。该方法主要依赖于表面增强拉曼(SERS)技术结合脂多糖的特殊化学反应实现脂多糖的定量分析检测。作为糖类分子,脂多糖可以被高碘酸钠氧化生成产物甲醛。甲醛又可以与一种特殊的含有巯基的反应探针Purpald加成,加成产物经二次氧化后,最终通过巯基组装在多肽保护的纳米金表面,同加成反应之前的试剂相比,产生了浓度依赖的SERS增强信号。从而,我们实现了脂多糖较为灵敏的定量分析,检测限可达21μg/mL。此外该方法在脂多糖浓度为33μg/mL到667μg/mL范围内具有良好的线性关系。综上,本实验为革兰氏阴性细菌标志分子脂多糖的分析检测及医学研究提供了一种简便,经济,快速的有效手段。
【学位授予单位】:湖南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:O657.3

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