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《湖南大学》 2017年
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特异性识别金属离子和肿瘤细胞的新型功能核酸荧光探针的研究

符婷  
【摘要】:随着人们对疾病诊断要求的不断提高,我们迫切需要发展灵敏度更高、选择性更好、操作简单且成本低廉的生物传感器,以便更好地满足科学研究和实际应用的需求。功能核酸是具有特殊分子识别功能的核酸分子,主要通过体外筛选获得,具有结合力强、选择性好、靶标范围广、生物相容性好、易合成及易功能化修饰等优点,因此被广泛用于诊疗、成像、药物的筛选及开发、分离、材料科学、纳米技术、生物传感等领域。功能核酸主要包括三大类,一类是与靶分子结合后表现出与蛋白酶相似的催化活性的核酸分子,称为脱氧核酶(DNAzyme);另一类核酸分子像抗体一样能够特异性识别靶标,包括金属离子、小分子、药物、蛋白甚至是整个细胞,称为核酸适体(Aptamer);第三类是一段具有发夹结构的茎-环双标记的核酸序列分子,称为分子信标(Molecular Beacon)。分子信标的两端分别修饰有淬灭基团和荧光基团,能特异性识别目标DNA。功能核酸的出现为疾病的早期诊断及靶向治疗提供了新的分子识别工具。然而天然的功能核酸一般是D型核酸,在实际样品中易酶解、易与非靶标蛋白和非靶标核酸结合造成脱靶效应,从某种程度上限制了功能核酸的应用。因此,如何改善功能核酸对靶分子的特异性和亲和性是发展功能核酸分子识别工具所面临的重要挑战。基于对映异构体概念,科学家们设计合成了与天然D型核酸互为镜像异构的L型核酸。L型核酸与D型核酸具有相似的热稳定性,但拥有更好的生物稳定性,是构建用于复杂体系检测的生物传感器的理想材料。现有的核酸荧光探针存在生物稳定性差、标记费用高、生物相容性差等问题,难以用于复杂生物体系的研究,本论文利用功能核酸及金属有机框架材料的优势,将核酸分子工程技术与纳米技术相结合,开发了一系列可用于复杂生物体系的新型功能核酸荧光探针。具体内容如下:(1)在第2章中,报道了一种基于DNAzyme和G-四链体的非标记荧光探针用于Pb~(2+)的放大检测。利用辅因子铅离子诱导催化酶切循环反应,释放出富G序列,进一步形成荧光增强的原锌卟啉(Zn PPIX)/G-四链体超分子结构,用于复杂样品中Pb~(2+)的检测,线性范围为5 n M-100 n M,检测限低至3 n M。该生物传感器灵敏度高、选择性好,成功地检测了河水样品中的Pb~(2+),为环境和生物医学领域的各种目标物检测提供了一个通用平台。(2)在第3章中,根据手性底物互惠特异性原则,设计合成了一种新型的Cu~(2+)依赖型的L型DNA酶,结果显示在金属离子辅因子存在的情况下,L型DNA酶拥有与D型DNA酶相似的催化活性,但在生物基质中显现出更好的生物稳定性。以具有良好抵抗生物基质干扰能力的L型DNA酶为识别单元,我们开发了能在生物样品中检测金属Cu~(2+)的L型DNA酶传感器,该传感器的检测下限为5n M,有望用于活体细胞中金属离子的检测。(3)针对核酸适体在生物体系中易被酶解、易脱靶等缺点,在第4章中,我们基于有序分子识别的策略对核酸适体进行了改造,提高了适体的稳定性。通过对核酸适体或抗体修饰PEG5000-偶氮苯,利用空间效应阻碍核酸适体或抗体与其靶标之间的相互作用,在核酸适体或抗体到达靶向组织前降低其结合能力和脱靶效应。到达靶向组织后,PEG5000-偶氮苯被偶氮还原酶还原性切割,释放出完整的核酸适体或抗体以识别癌细胞。(4)近年来基于锆离子的纳米金属有机框架材料(Zr-NMOFs)受到广泛关注,该结构具有良好的稳定性和生物相容性,可以保护核酸免受核酸酶降解和生物降解。在第5章中,我们构建了核酸适体功能化的Zr-NMOFs,并将其用于靶向生物成像和靶向光动力学治疗。核酸适体可特异性识别靶细胞,G4结构可装载光敏剂,同时通过3'端荧光修饰即可实现靶向生物成像与光动力学治疗。该纳米材料制备过程简便,可作为高效负载光敏剂的载体。小鼠实验结果也表明,该纳米递送体系具有较好的治疗效果和较低的副作用。
【学位授予单位】:湖南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R318.08;O657.3

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