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《湖南大学》 2017年
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基于核酸探针的高灵敏信号放大和高效细胞输送方法研究

吴振坤  
【摘要】:核酸分子探针是近些年来发展起来的生物分析领域中的一项重要技术。核酸分子探针具有性质稳定,序列可变,易于修饰等特点,被广泛应用于核酸、小分子、金属离子、蛋白、酶、转录因子甚至细胞等生物分析物的检测。同时随着近年来核酸信号放大技术和纳米技术的发展,通过将传统的核酸分子探针与核酸信号放大或纳米材料相结合,大大提升了核酸分子探针的稳定性、灵敏度、响应速度等分析性能,促进了核酸分子探针在活细胞、活体等复杂生物环境中的应用。本论文以核酸分子探针为研究基础,同时结合纳米材料和核酸信号方法技术,建立了多种简单、选择性好、灵敏度高的生物传感新技术用于单核苷酸多态性(SNP)检测、细胞内mRNA的多组分同时成像分析、细胞内源性金属离子的检测,和细胞内端粒酶活性分析。具体研究内容如下:一、基于T7核酸外切酶实现对单碱基错配的循环放大分析单核苷酸多态性(SNP)指的是一段DNA序列中单个碱基的改变从而引起物种之间染色体基因组的多样性。由于单核苷酸多态性和一些重大疾病等有着紧密的关系,因此对单核苷酸多态性的快速准确分析对于临床检测与诊断来说具有十分重要的意义。在第2章中,我们建立了一种基于T7核酸外切酶的生物传感新方法来实现对单碱基错配的循环方法检测。由于T7核酸外切酶能够沿着5'-3'方向切割DNA双链,因此当两条DNA链完全互补杂交时,T7核酸外切酶能够迅速酶切降解DNA链。如果当DNA链的5'末端碱基与对位碱基形成错配时,T7核酸外切酶的酶切效率被极大的抑制,从而实现了对单碱基错配的区分。基于此原理,我们首次报道了一种基于氧化石墨烯纳米片的目标循环放大技术来对单碱基错配进行区分。当目标与探针完全互补杂交时,T7核酸外切酶快速酶切FAM荧光团标记的DNA探针,导致FAM荧光不能被氧化石墨烯纳米片淬灭;当目标与探针在5'末端形成了单碱基错配时,由于T7核酸外切酶不能高效的酶切降解FAM标记的探针,使得荧光仍然能够被氧化石墨烯纳米片淬灭。由于结合了目标循环方法反应,使得本方法的检测下限可以低至4pM。实验结果证明,本章中建立的方法能够精准、灵敏同时廉价的实现对单核苷酸多态性的检测。二、基于DNAzyme-催化发夹组装探针对活细胞内源性金属离子的检测与成像金属离子在众多生物学功能中扮演着十分重要的作用,在生物体内金属离子含量的过高或不足都会扰乱正常的生理学功能。为了更好的理解金属离子在生物活动中的功能,检测细胞内金属离子的位置和浓度变得十分重要。DNAzyme近些年来成为金属离子检测的很有潜力的平台,一系列基于DNAzyme的生物传感器也已成功被应用于检测细胞内的金属离子。然而,这些已报道的方法需要依靠细胞通透来增加细胞内的金属离子浓度才能检测到信号。为了解决这个问题,在第3章中,我们利用催化发夹组装(Catalysis Hybridization Assembly,CHA)信号放大技术来放大由光保护的钠离子特异性响应DNAzyme所产生的信号,以实现对细胞内源性钠离子的检测。在光激活以及钠离子存在时,NaA43 DNAzyme切割底物链序列,释放出DNA引发链并引发后续的CHA信号放大反应,实现对钠离子的灵敏检测。通过共聚焦显微镜为单细胞成像以及流式细胞仪对大量细胞进行荧光分析,证明此方法能够实现对细胞内源性钠离子的检测。因为大部份被报道的用于金属离子检测的DNAzyme都有着非常类似的二级机构,因此在本章中所建立的此方法能够提高任意一种DNAzyme的灵敏度实现对低浓度金属离子的检测,使得我们能够对金属离子在生物系统中的功能有一个能深入的了解。三、荧光嵌段共轭高分子-DNA组装纳米探针对活细胞内多组分mRNA同时成像信使RNA(mRNA)在很多生物学功能上起着重要的作用,比如癌症。很多的mRNA都与癌症紧密相关,并且能够作为评估肿瘤转移的生物标志物。因此,能够准确检测细胞内mRNA的浓度以及其含量的变化是极其重要的。在第4章中,我们建立了一种新型的基于静电组装的DNA-荧光嵌段共轭高分子纳米探针来实现对活细胞内多组分mRNA的同时检测。两种不同的分别修饰了荧光团和淬灭团的DNA探针通过静电作用组装到纳米粒子表面。当目标mRNA不存在时,其荧光被淬灭团淬灭。当目标mRNA存在时,mRNA与响应探针杂交,打开发夹探针引起构象变化,使得荧光恢复。由于此荧光嵌段共轭高分子粒子具有自发荧光,可以作为纳米探针细胞转染过程的示踪试剂以及荧光比率成像的参比信号,避免了假阴性信号的出现;其次同时对两种肿瘤相关mRNA的成像,提升了对疾病诊断的准确性,避免假阳性信号的出现。本章的工作有望建立一个新型的生物分析平台来实现对细胞内目标物的准确检测,同时推动荧光嵌段共轭高分子纳米材料在生物分析领域的应用。四、静电组装核酸纳米探针对细胞内端粒酶活性的可视化检测端粒酶是通过使用逆转录和其内在RNA作为模板,催化将端粒重复序列(TTAGGG)n添加到人染色体的3'末端的核糖核蛋白酶。端粒酶是细胞增殖和分化的基础,且端粒酶与各种疾病如癌症和干细胞疾病有着密切的联系。这使得端粒酶成为一个重要的治疗靶标和追踪恶性肿瘤进展的有价值的标志物。在第5章中,我们建立了一种静电组装核酸纳米探针来对细胞内的端粒酶进行可视化检测。此纳米探针主要包括一个在中心位置的金纳米粒子,修饰在金纳米粒子上的阳离子多肽,以及通过静电组装在外层的荧光标记的DNA探针。阳离子多肽的N端为半胱氨酸,含有一个活性巯基基团,可以通过Au-S键将多肽修饰到纳米金表面,多肽的C端为三个甲基修饰的赖氨酸,带有正电荷。当端粒酶存在时,端粒酶结合DNA探针的引物序列,延伸并引起探针构象变化,使得荧光恢复。这种新型的DNA纳米探针具有生物相容性好,稳定性高等特点,同时提供了一种高效的细胞质输送方法。我们相信这种新型的DNA输送响应方法能够实现对端粒酶生物学作用的更好理解,并且提供了一种很好的潜在平台用于生物标志物的检测以及疾病诊断等。
【学位授予单位】:湖南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:O657.3

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