收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

遗传编码核糖核酸生物传感新方法研究

应站明  
【摘要】:荧光染料特异性结合核糖核酸(RNA)适配体发光作为生物传感的新方法,是近年来分析化学和生命科学交叉领域的一个重要突破。人们把这种发光的核糖核酸-染料复合物,称之为“点亮”探针。此类探针不仅仅可用于体外目标物的检测,比如环境中的重金属、细胞提取物中的代谢小分子、重要的功能蛋白,它还可作为一个类似绿色荧光蛋白(GFP)的“标签”分子,被广泛应用于活细胞荧光成像,对细胞内目标RNA分子进行示踪、动力学研究及细胞成分的定量研究,这类“标签”分子主要以“Spinach”(菠菜)为代表。除此之外,还有黄酰罗丹明B-适配体复合物,作为生物传感器点亮探针应用在原核生物中,连有二硝基氟苯的黄酰罗丹明B共轭物在没有结合适配体的时候,处于荧光猝灭的状态,当与适配体结合后,由于空间构象变化,使荧光团与猝灭基团分开,从而导致荧光团重新恢复荧光。点亮核糖核酸适配体,不仅可以通过体外合成方法得到,还可以通过基因工程在活细胞内编码而成。它主要是利用宿主细胞本身的遗传调控机制,将人为设计拼接好的标准化基因模块表达出来,产物不仅仅是RNA适配体序列,也可以是蛋白分子。通过构建各种不同的质粒载体,在活细胞中表达出RNA适配体的生物传感器元件,用于细胞内重要的代谢小分子、疾病标记核糖核酸和功能蛋白分子的检测,这种将合成生物学与分析化学交叉应用的研究越来越广泛,已经成为化学生物学领域的一个重要分支。本文主要通过结合核糖核酸适配体-荧光团探针、合成生物学方法和活细胞荧光成像等技术,设计了一些生物传感的新方法用于体外microRNA、PSA的分析检测,活的肿瘤细胞内miRNA比率型荧光成像、活细胞内mRNA绝对定量成像研究、以及肿瘤细胞内mRNA响应CRISPR/Cas9体系对点亮核糖核酸序列的转录激活成像。其主要内容包括:miRNA是一种长度为19-22个非编码的核苷酸,是细胞内普遍存在的小分子,在真核细胞内具有基因表达调控作用,它的特异性表达与人类多种肿瘤疾病密切相关,已有多个miRNA分子作为肿瘤细胞的标记分子为人们所认识。在第2章中,通过设计DNA探针与miRNA目标分子发生杂交,利用SplintR酶对RNA-DNA底物的特异性,引发T7体外转录反应,产生未经修饰的核糖核酸适配体,当与其相对应的染料分子(DFHBI或MG)结合时,核酸适配体能够激活染料发出荧光,可以得到高信背比,低背景,高特异性的信号,从而达到检测miRNA分子的作用,检测下限低至3 pM。除了核酸分子可作为疾病标记分子外,蛋白分子前列腺抗原(PSA)也被作为前列腺癌的疾病标记物,它已经成为常规的临床检测项目。第3章中,利用“邻近连接”偶合体外转录体系(PLTA)检测PSA分子,即在某一空间内,因“邻近效应”,探针的浓度大大提高,从而可以和短片段的接头DNA片段发生桥连杂交,当有T7引物和RNA聚合酶存在的时候,引发后续的T7体外转录反应,产生的核糖核酸适配体,与染料分子结合发光,依据荧光信号强度检测血清中PSA的含量,检测下限可达0.15 ng/mL。核糖核酸适体还可通过细胞内遗传编码的点亮探针用于活细胞内目标分子检测。在第4章中,利用点亮RNA适配体结合黄酰罗丹明B染料,使其与猝灭基团分离,设计了一种新的基于遗传编码的RNA传感器,用于活细胞内的miRNA-21成像研究。利用分子信标构象互变设计原理,当RNA传感器与目标分子发生杂交后,能够重新激活不发荧光的SR-DN共轭物发出荧光,得到了较高的信背比信号。通过细胞内RNA传感器和GFP内参蛋白共表达,本研究不仅实现了在肿瘤细胞中对miRNA的双发射比率型成像,而且可以对活细胞内目标分子进行定量研究。因转录酶效率间的差异,会存在探针与内标信号两者生成效率在细胞间有差异的问题,影响定量分析的可靠性。在第5章中,利用单个启动子质粒载体,转录出一条长的RNA转录体,该转录体能够同时形成核糖核酸生物传感器和GFP蛋白参比信号,可用于检测活细胞内Survivin信使RNA。该转录体中同时包括传感器序列,三螺旋结构,Dicer酶切序列以及GFP基因。本章设计的核糖核酸生物传感器及参比信号的鲁棒性能更加优越,不仅实现了肿瘤细胞内的mRNA比率型成像,还可以对细胞内mRNA的拷贝数进行绝对定量研究。遗传编码的点亮探针不仅仅可对细胞内RNA检测,还可以对细胞内基因表达的过程进行可视化研究,使人们能够实时、原位且清晰地“看见”生物体内基因表达的动态变化,在第6章中,构建了两个质粒载体,利用CRISPR系统,通过Survivin信使RNA对gRNA序列响应,激活点亮核糖核酸适配体的表达,可以“看见”细胞内转录过程的发生。实验设计的两个载体,一个用于编码封闭的gRNA序列,另一个除包括dCas9-VP64蛋白表达元件之外,在该元件上游还包括一个miniCMV启动的核糖核酸适配体转录区。当细胞内RNA分子存在的时候,与封闭的gRNA发生链置换,gRNA序列中封闭的20 nt长度的引导序列被打开,导致其与miniCMV启动子上游的DNA序列结合杂交,能够将与dCas9融合的VP64蛋白带至miniCMV启动子区,从而提高核糖核酸适配体的转录水平,实现肿瘤细胞内RNA转录的响应成像研究。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前17条
1 许涛;彭智辉;王泽峰;周佳琪;邓乐;;核酸适配体筛选技术研究进展[J];生物技术通讯;2018年01期
2 汪靖;王进;曾家豫;;核酸适配体结合蛋白质靶标的亲和力表征方法及其在疾病诊断中的应用[J];中国生物化学与分子生物学报;2018年04期
3 李亚楠;赵洁;张傲哲;谭琰;华茜;张子剑;;核酸适配体的体外筛选方法的最新研究进展[J];生物技术通报;2017年04期
4 胡涛;杨帆;杨秀荣;;双偏振极化干涉技术实时研究三磷酸腺苷与其适配体相互作用[J];分析化学;2017年07期
5 刘洪美;栾云霞;陆安祥;陈佳祎;李成;王纪华;;核酸适配体在小分子目标物快速检测中的应用[J];食品安全质量检测学报;2017年08期
6 陈尔凝;赵新颖;屈锋;;细菌的核酸适配体筛选的研究进展[J];色谱;2016年04期
7 ;中科大筛选出特异针对点突变蛋白的适配体[J];中国科学院院刊;2015年05期
8 ;中国科学技术大学筛选出特异针对点突变蛋白的适配体[J];中国材料进展;2015年Z1期
9 仲津漫;刘鸽;文娣娣;宦怡;任静;;前列腺癌适配体的研究进展及其应用[J];现代生物医学进展;2015年29期
10 董理权;吴小高;;构建辅助器具适配体系探讨[J];残疾人研究;2014年02期
11 王开;裴志花;曲桂娟;马红霞;;适配体药物的研究现状及其在传染病防制领域的应用前景[J];中国预防兽医学报;2013年04期
12 ;生物分析中的核酸适配体[J];分析化学;2012年05期
13 申睿;唐吉军;张朝阳;郭磊;谢剑炜;;基于磁珠分离的酶联适配体检测痕量蛋白质的新型比色分析方法[J];高等学校化学学报;2009年04期
14 张月侠;宋茂勇;李涛;赛道建;汪海林;;适配体的筛选及在生命分析化学中的应用[J];生物技术;2009年05期
15 陈芳明;陈炜;王健;杜立萍;吴春生;王平;;适配体在受体和分子传感器中的应用研究进展[J];中国科学:生命科学;2018年06期
16 孟凡飞;孟凡娜;熊琦;罗小舸;蒲晓允;;电化学适配体传感器的研究进展[J];检验医学与临床;2018年21期
17 王薇薇;刘素琴;薛芸;王彦;阎超;;核酸适配体在固相萃取技术中的研究进展[J];色谱;2017年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 屈锋;杨歌;魏强;胡猷浩;;核酸适配体三维度筛选策略初探[A];中国化学会第十一届全国生物医药色谱及相关技术学术交流会(材料分析与其它分会)论文摘要集[C];2016年
2 王开宇;林建敏;兰小鹏;;基于适配体茎环开关和链置换放大技术的铅离子荧光适配体传感器[A];第六届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛论文汇编[C];2015年
3 林雪霞;林金明;;可控核酸适配体-芯片毛细管电泳用于细胞代谢物的研究[A];第二十届全国色谱学术报告会及仪器展览会论文集(第二分册)[C];2015年
4 上官棣华;邴涛;刘祥军;乞萃;梅宏成;张楠;常天俊;杨晓娟;;用于高选择性分离分析的核酸适配体研究[A];中国分析测试协会科学技术奖发展回顾[C];2015年
5 王梁华;胡波;郑欣;高顺祥;刘德婧;孙铭娟;焦炳华;;建立海洋生物毒素适配体筛选与优化技术平台[A];全国第九届海洋生物技术与创新药物学术会议论文摘要集[C];2014年
6 陈巍;赵新颖;屈锋;;毛细管电泳法筛选蛋白质的核酸适配体的初步研究[A];全国生物医药色谱学术交流会(2010景德镇)论文集[C];2010年
7 马文韬;古力;屈锋;;毛细管电泳筛选大肠杆菌适配体的初步研究[A];全国生物医药色谱学术交流会(2010景德镇)论文集[C];2010年
8 杨晓娟;邴涛;梅宏成;上官棣华;;核酸适配体用于手性拆分L型和D型色氨酸[A];全国生物医药色谱学术交流会(2010景德镇)论文集[C];2010年
9 蔡圣;刘彩云;卢建忠;;基于核酸适配体和酶循环放大的腺苷化学发光检测[A];中国化学会第十届全国发光分析学术研讨会论文集[C];2011年
10 郑冬梅;娄新徽;;一种基于结构开关型适配体的无标记荧光传感法[A];中国化学会第28届学术年会第9分会场摘要集[C];2012年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 应站明;遗传编码核糖核酸生物传感新方法研究[D];湖南大学;2018年
2 程莉娟;功能核酸控制沙门氏菌致病性的研究[D];湖南师范大学;2018年
3 朱泽策;金属配合物发光探针与核酸传感器的设计、合成及性能研究[D];武汉大学;2014年
4 李潮;基于适配体的微梁阵列生化传感技术研究[D];中国科学技术大学;2018年
5 王亚;基于核酸适配体及碳点的荧光分析方法构建及应用研究[D];华东师范大学;2018年
6 白琛俊;类CAR多价适配体的构建及其激活T淋巴细胞并靶向杀伤肺癌细胞的初步应用&H1N1甲型流感病毒特异性适配体的筛选与鉴定[D];军事科学院;2018年
7 李旭;消化系统肿瘤相关危险因素及适配体在其诊断及靶向治疗中的作用[D];吉林大学;2018年
8 黄玉坤;基于核酸适配体识别-时间分辨荧光纳米探针的生物毒素检测方法研究[D];江南大学;2015年
9 陈秀娟;镰刀菌毒素核酸适配体的筛选及分析应用研究[D];江南大学;2015年
10 王成全;基于磁控适配体传感体系的农产品中典型霉菌毒素检测研究[D];江苏大学;2016年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 丁海洋;以天然蛋白丝为载体的CTC捕获及其毛细管电泳筛选CTC的核酸适配体[D];苏州大学;2018年
2 陈虹妃;基于适配体识别作用的前列腺肿瘤外泌体的电化学信号放大检测[D];南京师范大学;2018年
3 赵静;核酸适配体应用于乳制品中抗生素残留比色检测研究[D];贵州大学;2018年
4 邹颖;不同生长期大肠杆菌O157:H7适配体的筛选及应用研究[D];江南大学;2018年
5 谢晓慧;适配体修饰核壳纳米材料表面增强拉曼光谱检测17β-雌二醇方法研究[D];华南理工大学;2018年
6 孟云;基于聚集诱导发光的真菌毒素和金属离子检测新方法研究[D];石河子大学;2018年
7 赵旭;重金属镉离子可视化检测方法研究[D];江南大学;2018年
8 刘丽红;真菌毒素快速检测适配体试纸条的研究[D];江南大学;2018年
9 李洁;基于核酸适配体技术对食品中吊白块的胶体金试纸条研究[D];昆明理工大学;2018年
10 韩旭艳;氨基糖苷类抗生素特异性单链DNA适配体的筛选及其应用研究[D];江南大学;2018年
中国重要报纸全文数据库 前5条
1 潘文;核酸适配体在医药领域应用前景广阔[N];中国医药报;2010年
2 黄旻 殷向佳;走在分子抗癌的路上[N];团结报;2015年
3 于洋 田野;蛋白质检测有了新方法[N];吉林日报;2011年
4 本报记者 谢水旺;陆金所首席风控官杨峻:信用评级等传统风控技术仍是最有效的[N];21世纪经济报道;2016年
5 记者 吴长锋 通讯员 周慧;重金属超标实现快速实时检测[N];科技日报;2016年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978