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《湖南大学》 2018年
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高选择性荧光探针构建及其在炎症和药物诱导肝损伤检测中的应用

程丹  
【摘要】:荧光分析法由于分析灵敏度高、选择性好及操作较简便等许多优点而倍受广大科学家的青睐,并且荧光成像拥有实时原位可视化检测、对生物样品损伤小、重现性能好等其他检测方法所不具备的优点。炎症和药物诱导肝损伤近年来被认为是一个严重关系到公共健康的问题,因此高灵敏、高选择的精准检测炎症和药物诱导肝损伤过程中的生物标志物,将有助于人们更深入地了解这些疾病的发生与发展机制,对其进行及时预防和针对性治疗。过氧化亚硝酰阴离子(ONOO~-)和亮氨酸氨基肽酶(LAP)是已知的药物诱导肝损伤的生物标志物,然而由于ONOO~-的强氧化性和亲核性,一些发射在可见光或近红外光范围内的染料易被ONOO~-破坏,一方面会造成很多ONOO~-荧光探针选择性欠佳,另一方面会导致在检测过程中ONOO~-和LAP荧光探针出现假信号,最终导致检测结果不准确。因此为解决这一问题,本文致力于提高荧光探针的选择性、灵敏度和准确性,通过合理设计和染料筛选策略相结合构建了一系列双光子或近红外荧光探针。基于香豆素、萘酰亚胺、罗丹明和长沙染料为荧光信号团,分别设计合成了ONOO~-和LAP荧光探针。具体内容如下:第一,通过合理设计和染料筛选策略相结合,我们发展了一个双光子比率荧光探针MITO-CC,用于选择性检测体外和生物环境中的ONOO~-。基于FRET机理的比率探针MITO-CC不仅表现出高灵敏度(11.30 nM)、对ONOO~-的快速响应(20 s内),而且在生理pH水溶液中能避免其它各种生物活性氧和活性氮的干扰而高选择性的检测ONOO~-。探针MITO-CC不仅具有较小的细胞毒性,且被成功应用于比率检测细胞和组织中内源性ONOO~-。此外,探针MITO-CC也可检测小鼠炎症模型中LPS刺激产生的ONOO~-。该探针对于揭示在各种生理和病理条件下ONOO~-的作用方面具有很好的应用前景。第二,为了发展普适性荧光探针,基于ONOO~-介导的α-酮酰胺的脱保护反应机制,我们进一步设计合成了两个ONOO~-荧光探针Naph-ONOO~-和Rhod-ONOO~-。这些探针不仅可以不受其他生物物种的干扰高特异性的检测体外ONOO~-,而且能够原位成像和实时监控生物体内ONOO~-的生成。其中,基于萘酰胺荧光团的双光子荧光探针Naph-ONOO~-可实现单/双光子成像。另一个主要累积在线粒体中的探针Rhod-ONOO~-表明药物诱导氧化应激过程中ONOO~-主要产生在线粒体。另外,我们首次通过CYP450家族氧化酶介导的外源物代谢过程追踪到了ONOO~-的生成,深入探索了药物性肝毒性修复的途径。第三,为了更深入探索药物诱导肝损伤过程,我们结合近红外荧光染料筛选和合理设计策略,构建了小分子近红外荧光探针NIR-ONOO~-和NIR-LAP,它们能够高选择、高灵敏地检测生理条件和生物体系中ONOO~-和LAP的变化水平。另外,利用近红外探针独特的光学特性,通过近红外荧光成像,NIR-ONOO~-和NIR-LAP也准确检测了APAP诱导的活细胞和小鼠肝毒性过程中ONOO~-和LAP两种生物标志物的微小波动,并评价了几种保肝药物对肝损伤小鼠的治疗效果。这两种近红外荧光探针的开发,为研究ONOO~-/LAP与药物诱导肝损伤之间的复杂关系提供了有效工具,有助于药物诱导肝损伤的诊断和治疗药物的开发。第四,本章中我们设计合成了一个基于反应型的双光子线粒体靶向荧光探针,MitoTP-ONOO~-。此探针能够分别在生理条件下和细胞中高选择、高灵敏地检测ONOO~-水平。结合以上工作发展的探针NIR-LAP,基于探针MitoTP-ONOO~-和NIR-LAP所具有的优良的双光子和近红外性质,我们拟利用这些探针实时检测APAP诱导肝损伤过程中ONOO~-和LAP的产生,深入揭示此过程中ONOO~-和LAP的不同变化,有望为药物诱导肝损伤的预防及治疗提供新思路。
【学位授予单位】:湖南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:O657.3;R318

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