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《湖南大学》 2018年
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低共熔溶剂应用于生物大分子的分离分析研究

徐凯佳  
【摘要】:蛋白质和核酸等生物大分子是生命体的物质基础,与各项生命活动息息相关。对蛋白质和核酸的结构以及功能的研究,无疑对于了解生命活动规律、指导工业生产以及医药实践都有着举足轻重的作用。但是各种生化研究都要求被分析物具有足够高的纯度。因此,发展更加高效、简单以及绿色的生物大分子的分离分析方法具有十分重要的意义。低共熔溶剂(Deep eutectic solvent,DES)作为一种新型绿色溶剂,由于具有原料来源丰富、合成简单以及产物无需提纯等优点,与其他分离技术相结合被广泛用于蛋白质和核酸的纯化。以低共熔溶剂作为成相剂所构建的低共熔溶剂双水相体系(Aqueous two-phase system,ATPS)有效地结合了低共熔溶剂和双水相萃取技术的优点,是一类具有良好生物相容性的萃取体系。低共熔溶剂磁性固相萃取技术(Magnetic solid-phase extraction,MSPE)是一种以低共熔溶剂改性的磁性材料作为萃取剂的固相萃取技术,具有操作简单、分离速度快和易于实现自动化的优点。低共熔溶剂分子印迹技术(Molecular imprinted technology,MIT)是将低共熔溶剂作为功能单体,合成一种与模板分子的空间结构和结合位点相匹配的聚合物的技术,所制备的聚合物机械强度高、稳定性好且使用寿命长。本研究设计合成了多种低共熔溶剂,分别结合双水相萃取技术、磁性固相萃取技术和分子印迹技术,建立了蛋白质和DNA的分离纯化新方法。主要研究内容如下:(1)氯化胆碱类低共熔溶剂双水相体系萃取蛋白质合成了四种基于氯化胆碱的低共熔溶剂,结合无机盐构建双水相体系用于蛋白质的萃取分离。选择牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)作为目标蛋白,氯化胆碱-甘油被选为最优低共熔溶剂萃取剂。通过单因素实验考察了低共熔溶剂的加入量、盐浓度、蛋白质的加入量、振荡时间、温度和pH值对蛋白质萃取率的影响。在最佳萃取条件下,体系对牛血清白蛋白的萃取率可达98.16%,同时对胰蛋白酶(Trypsin,Try)也有高达94.36%的萃取率。反萃取实验结果表明,牛血清白蛋白的反萃取效率可以达到32.96%。方法精密度、重复性和稳定性验证结果表明,该方法具有良好的精密度、重复性和稳定性。紫外可见光谱(UV-vis spectrometry)、傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectrometry,FT-IR)和圆二色谱(Circular dichroism,CD)研究结果表明,蛋白质的构象在萃取过程中没有发生改变。采用电导率测定法、动态光散射法(dynamic light scattering,DLS)和透射电子显微镜技术(transmission electron microscopy,TEM)探究了蛋白质的萃取机理,结果表明低共熔溶剂和蛋白质簇集物的形成在萃取过程中发挥了重要作用。本实验所建立的方法为蛋白质的萃取分离提供了一种新思路。(2)低共熔溶剂修饰的磁性氧化石墨烯固相萃取蛋白质合成了四种基于氯化胆碱的低共熔溶剂,将其负载在氨基功能化的磁性氧化石墨烯(Fe_3O_4-NH_2@GO)表面,合成了Fe_3O_4-NH_2@GO@DES复合材料,并用于蛋白质的磁性固相萃取。采用振动样品磁强计(Vibrating sample magnetometer,VSM),X-射线衍射仪(X-ray diffraction,XRD)、傅里叶变换红外光谱仪、热重分析仪(Thermal gravimetric analysis,TGA)、场发射扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscopy,FESEM)和zeta电位仪对Fe_3O_4-NH_2@GO@DES进行了表征。以牛血清白蛋白为目标蛋白,研究了Fe_3O_4-NH_2@GO@DES在萃取过程中的萃取性能。通过紫外可见分光光度计在278nm处测定牛血清白蛋白的浓度。与没有低共熔溶剂修饰的磁性萃取剂相比较,Fe_3O_4-NH_2@GO@DES对牛血清白蛋白具有更高的萃取容量,可达44.59 mg/g。通过单因素实验考察了pH值、温度、萃取时间、蛋白质浓度和Fe_3O_4-NH_2@GO@DES加入量对萃取过程的影响。以1 mol/L NaCl-0.1 mol/L Na_2HPO_4的水溶液作为洗脱液对含有牛血清白蛋白的萃取剂进行洗脱,洗脱率可达98.73%。圆二色谱研究结果表明,蛋白质的二级结构在洗脱后没有发生改变。实际样品分析证明,Fe_3O_4-NH_2@GO@DES可以成功地从小牛血中萃取出牛血清白蛋白。方法重复性、精密度和稳定性验证结果表明,该方法具有良好的重复性、精密度和稳定性。本实验所建立的方法为蛋白质的萃取分离提供了一种新思路。(3)新型聚合低共熔溶剂修饰的磁性二氧化硅复合物固相萃取胰蛋白酶合成了一种含双键的氯化胆碱-衣康酸低共熔溶剂,通过乳液聚合反应将聚合低共熔溶剂(Polymeric deep eutectic solvent,PDES)包覆在γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ-methacryloxy propyl trimethoxy silane,γ-MPS)修饰的磁性二氧化硅(Fe_3O_4@SiO_2-MPS)表面,合成了Fe_3O_4@SiO_2-MPS@PDES复合材料。采用振动样品磁强计、傅里叶变换红外光谱仪、X-射线光电子能谱仪(X-ray photoelectron spectra,XPS)、热重分析仪、透射电子显微镜和zeta电位仪对Fe_3O_4@SiO_2-MPS@PDES进行了表征。以胰蛋白酶为目标蛋白,研究了Fe_3O_4@SiO_2-MPS@PDES在萃取过程中的萃取性能。通过紫外可见分光光度计在278 nm处测定胰蛋白酶的浓度。通过单因素实验探究了胰蛋白酶浓度、离子强度、pH值、萃取时间和温度对萃取过程的影响。在最佳萃取条件下,Fe_3O_4@SiO_2-MPS@PDES对胰蛋白酶的萃取容量可达287.5 mg/g。与没有修饰聚合低共熔溶剂的磁性萃取剂相比,Fe_3O_4@SiO_2-MPS@PDES对胰蛋白酶具有更高的萃取容量和选择性。重复利用实验表明,Fe_3O_4@SiO_2-MPS@PDES在重复利用八次后对胰蛋白酶仍有高达233 mg/g的萃取容量。活性研究表明,萃取后的胰蛋白酶活性保留了初始活性的96%。实际样品分析证明,Fe_3O_4@SiO_2-MPS@PDES可用于牛胰脏粗提物中胰蛋白酶的分离纯化。方法精密度、重复性和稳定性验证结果表明,该方法具有良好的精密度、重复性和稳定性。本实验所建立的方法为蛋白质的萃取分离提供了一种新思路。(4)聚乙二醇类低共熔溶剂修饰的磁性壳聚糖多壁碳纳米管固相萃取DNA合成了八种基于聚乙二醇的低共熔溶剂,将其包覆在壳聚糖修饰的磁性多壁碳纳米管(mCS/MWCNT)表面,合成了DES-mCS/MWCNT复合材料,并用于鲑鱼精DNA的磁性固相萃取。采用X-射线衍射仪、振动样品磁强计、傅里叶变换红外光谱仪、热重分析仪、透射电子显微镜和zeta电位仪对DES-mCS/MWCNT进行了表征。通过单因素实验考察了DNA浓度、离子强度、pH值、温度和萃取时间对萃取过程的影响。在最佳萃取条件下,DES-mCS/MWCNT对DNA的萃取容量可达178 mg/g。与没有低共熔溶剂修饰的磁性萃取剂相比,DES-mCS/MWCNT对DNA具有更高的萃取容量。混合样品萃取实验表明,DES-mCS/MWCNT可以从DNA和牛血红蛋白(Bovine hemoglobin,BHb)的混合液中选择性萃取DNA。以1 mol/L NaCl作为洗脱液对含有DNA的萃取剂进行洗脱,洗脱率可达79%。圆二色谱研究结果表明,DNA的二级结构在洗脱后没有发生改变。实际样品分析证明,DES-mCS/MWCNT可以成功从小牛血中萃取出DNA。方法精密度、重复性和稳定性验证结果表明,该方法具有良好的精密度、重复性和稳定性。本实验所建立的方法为DNA的萃取分离提供了一种新思路。(5)基于低共熔溶剂的磁性分子印迹聚合物特异性识别溶菌酶以磁性二氧化硅(Fe_3O_4@SiO_2)为载体,以低共熔溶剂为功能单体,以溶菌酶(Lysozyme,Lys)为模板分子,通过表面分子印迹技术制备了磁性分子印迹聚合物(DES-Fe_3O_4@SiO_2-MIP),并用于溶菌酶的选择性吸附。采用X-射线衍射仪、傅里叶变换红外光谱仪、透射电子显微镜、热重分析仪和振动样品磁强计对DES-Fe_3O_4@SiO_2-MIP进行了表征。实验探究了功能单体的种类和加入量对印迹聚合物的吸附性能的影响,结果表明,最佳聚合方案为选择低共熔溶剂作为功能单体且单体加入量为100μL。热力学吸附实验和动力学吸附实验结果表明,DES-Fe_3O_4@SiO_2-MIP可以在最适溶菌酶浓度1.2 mg/mL下7 h达到平衡,最大吸附量为108 mg/g,且其吸附等温线符合Langmuir模型。选择性吸附实验表明,DES-Fe_3O_4@SiO_2-MIP可选择性结合模板蛋白溶菌酶,印迹因子可达2.82,高于其他参比蛋白细胞色素c(Cytochrome c,Cyt c),牛血红蛋白和牛血清白蛋白。竞争吸附实验和实际样品分析实验结果表明,DES-Fe_3O_4@SiO_2-MIP可以从双组份蛋白混合溶液和复杂样品鸡蛋清中特异性结合溶菌酶。重复利用实验表明,DES-Fe_3O_4@SiO_2-MIP在重复使用四次后吸附容量仅有少量的降低。方法精密度和重复性验证结果表明,该方法具有良好的精密度和重复性。本实验所建立的方法为蛋白质的选择性分离提供了一种新思路。
【学位授予单位】:湖南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:O658;O629.7

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