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《中南大学》 2011年
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去卵巢、糖皮质激素、降钙素对雌性大鼠骨强度影响的实验研究

戴哲浩  
【摘要】:骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一组以骨量减少或(和)骨组织微细结构被破坏,骨强度下降,骨脆性增加、极易发生骨折为特征的全身性骨骼疾病。骨质疏松症的最终结局是脆性骨折,即骨质疏松症性骨折。骨质疏松症是目前世界上发病率、死亡率及医疗资源消耗较大的疾病之一。女性绝经后激素水平下降和糖皮质激素的长期使用,是骨质疏松症的常见病因。目前,部分绝经后女性由于各种其他疾病的原因需要长期使用糖皮质激素治疗,两种因素叠加对骨强度的影响研究甚少,这正是我们关注的焦点之一。降钙素是治疗骨质疏松症的主要药物,其能有效的降低绝经后骨质疏松症性骨折风险,但其对糖皮质激素性骨质疏松症是否有疗效却无一致意见,其是否适用于雌激素缺乏和糖皮质激素共同作用所致的骨质疏松症等问题也没有解决。在此基础上,本课题以实验动物10月龄SD大鼠为研究对象,分别建立大鼠去卵巢骨质疏松症模型,大鼠糖皮质激素性骨质疏松症模型,大鼠去卵巢及糖皮质激素骨质疏松症双模型,对这三种模型进行评定并对这三种模型进行横向比较;深入探讨此三种大鼠骨质疏松症模型建立后不同骨骼部位骨丢失敏感区的选择;研究鲑鱼降钙素对骨质疏松症防治的有效性;并对大鼠此三种骨质疏松症的发病机制、鲑鱼降钙素的防治作用机理进行初步探讨。为后续进行的临床试验建立动物实验基础。全文由三部分实验组成。 第三章骨质疏松动物模型的建立和评价 实验一对双能X线吸收法测定大鼠骨量的评价 目的:探讨双能X线吸收法测量大鼠骨密度(Bone mineral density,BMD)、骨矿含量(Bone mineral content,BMC)的精密度和准确度。 方法:用扇形束DXA重复测量20只SD大鼠不同骨骼区域BMD、BMC的变异系数评价精密度;测量18只大鼠骨矿含量和骨灰重比较评价准确度。 结果:DXA测量BMD的CV为全身(0.74±0.40)%,第四腰椎(1.47±0.57)%,第五腰椎(1.38±0.54)%,第六腰椎(1.38±0.48)%,股骨(0.54±0.28)%,胫骨(0.62±0.21)%,DXA测量BMC的CV全身(0.84±0.32),第四腰椎(1.37±0.67)%,第五腰椎(1.48±0.54)%,第六腰椎(1.44±0.39)%,股骨(0.72±0.34)%,胫骨(0.57±0.32)%;BMC与骨灰重呈高度正相关,BMC显著低于骨灰重。 结论:DXA测量大鼠骨量是一种精密而有效的方法。 实验二双能X线吸收法测定骨质疏松症大鼠模型骨量变化敏感区的选择 目的探讨双能X线吸收法(DXA)测定大鼠去卵巢后及大鼠接受糖皮质激素后骨量变化的敏感区域。 方法30只44周龄SD雌性大鼠分别假性去卵巢(SHAM组)、摘除双侧卵巢(OVX组)或注射甲基强的松龙(2.5mg·kg-1·d-1) (PRED组),应用扇形束DXA(QDR-4500A)每4周测定一次全身骨密度(BMD)、骨矿含量(BMC)、骨骼面积(AREA);术后12周处死,测定离体腰椎、股骨、胫骨及其兴趣区的BMD、BMC、AREA。 结果①术后8周开始OVX组体重显著重于同龄SHAM组(8周时,P0.05,12周时P0.01),术后4周开始PRED组体重显著轻于同龄SHAM组(P0.05);②术后12周OVX组整体BMC显著高于SHAM组(P0.05),术后8、12周OVX组整体BMC显著高于PRED组(P0.05);③术后12周OVX组离体第5、6腰椎BMD及第6腰椎BMC显著低于SHAM组和PRED组(P0.05);PRED组离体各腰椎BMD、BMC、AREA与SHAM组无明显差异;④术后12周与SHAM组比较,OVX组离体股骨(-7.45%)、股骨远端(-11.97%)和近端(-7.28%)、胫骨近端(-11.97%)BMD显著降低(P0.05);其中股骨、股骨远端、胫骨近端BMC也显著降低(P0.05)⑤术后12周与SHAM组比较,PRED组离体股骨及各区BMD、BMC、AREA无显著性差异;整体胫骨及各区BMD无显著性差异;⑥术后12周与SHAM组比较,OVX组及PRED组胫骨中远端骨量增加。 结论第六腰椎、股骨远端及近端干骺端和胫骨近端干骺端是成熟期大鼠去卵巢后骨丢失的最敏感区域;成熟期大鼠接受甲基强的松龙后,皮质骨和松质骨骨量没有显著变化,DXA检查难以发现其骨丢失情况。 实验三大鼠骨质疏松模型的建立与评定 目的:建立并评定大鼠去卵巢骨质疏松症模型,大鼠糖皮质激素性骨质疏松症模型,大鼠去卵巢及糖皮质激素骨质疏松症双模型,并对这三种模型进行横向比较。 方法:将70只44周龄SD雌性大鼠分为假手术组(SHAM组);去卵巢组(OVX组);注射甲泼尼龙大鼠组(PRED组);去卵巢+注射甲泼尼龙大鼠组(OVX+PRED组);降钙素干预去卵巢大鼠组(OVX+C组);降钙素干预甲泼尼龙处理大鼠组(PRED+C组);降钙素干预去卵巢+甲泼尼龙注射组(OVX+PRED+C组),每组10只大鼠。后3组用于第四章实验。OVX组切除双侧卵巢;SHAM组切除少许脂肪组织;PRED组每日皮下注射甲泼尼龙2.5mg/kg/d; OVX+PRED组同时接受去卵巢术及每日皮下甲泼尼龙注射2.5mg/kg/d。每隔4周行一次活体骨密度检测。术后3月,取血后处死。取椎骨、胫骨、股骨,去净软组织。分别行离体骨骨密度检测、骨组织计量学测量、三点弯曲试验、压缩实验、M1croCT扫描等。所得数据经SPSS16.0统计分析。 结果:手术顺利,术后3月,OVX后体重增加明显,注射糖皮质激素后体重明显降低,与SHAM组比较差异有统计学意义,复合模型大鼠体重变化不显著。子宫和子宫系数在行去卵巢手术的两组大鼠明显降低(P0.05)。 1、离体骨骨密度:股骨和胫骨按测量图像的长度,将其等分成7个区(R1~R7),各区被称为感兴趣区(ROI)。与SHAM组比较,OVX组腰椎、整体股骨及其远端(FROI-1、2)和近端(FROI-7)、整体胫骨及其近端(TROI-1~3) BMD显著丢失;PRED组骨丢失率不显著;OVX+PRED组骨丢失区域更广泛。 2、骨组织计量学分析表明:与SHAM组比较,OVX组、PRED组和OVX+PRED组小梁骨体积(BV/TV)和骨小梁数目(Yb.N)显著减少,骨小梁分离度(Tb.Sp)显著增加。OVX组Tb.Th没有显著的变化,BFR增加了118.94%,MAR增加了74.07%;PRED组Tb.Th降低了15.96%,BFR降低了28.46%,MAR降低了24.69%;OVX+PRED组Tb.N降低了51.48%,BFR却增加了29.67%,而MAR却无明显变化。 3、uCT测定大鼠胫骨近端骨微结构参数,其胫骨近端皮质骨微结构参数改变不显著。去卵巢后,大鼠松质骨骨小梁连接性迅速降低而骨小梁厚度变薄不明显;而激素处理的大鼠松质骨骨小梁厚度变薄明显;两因素同时处理大鼠时,松质骨各指标迅速恶化。 4、股骨干三点弯曲实验结果显示,去卵巢组最大载荷、最大应力、弹性载荷、弹性应力与SHAM组接近,差异不显著(P0.05)。PRED组与OVX+PRED组各项力学性能指标均低于假手术组(P0.05)。在第二腰椎中,OVX组、OVX+PRED组最大载荷与弹性模量显著低于假手术组(p0.01)。PRED组最大载荷显著低于SHAM组(p0.05),其最大载荷和弹性模量显著高于OVX+PRED组(p0.01)。OVX+PRED组的最大载荷和弹性模量低于SHAM组,但无显著性差异。 结论:造模操作简便易行,死亡率低。OVX后体重增加明显,注射糖皮质激素后体重明显降低,与SHAM组比较差异有统计学意义。复合模型大鼠体重变化不显著。造模三个月后,大鼠的骨量降低,骨小梁结构改变,骨生物力学性能变差:提示骨组织结构改变,材料性能亦有较大变化。确定了三种SD雌性大鼠骨质疏松症模型骨丢失和骨结构改变的敏感区域,为后续研究提供了理论基础。对骨量、骨结构按影响程度排序如下:去卵巢+注射甲泼尼龙去卵巢)注射甲泼尼龙。三种SD雌性大鼠骨质疏松症模型造模成功。 第四章降钙素干预骨质疏松症动物模型的研究 目的:评定降钙素对大鼠去卵巢骨质疏松症模型,大鼠糖皮质激素性骨质疏松症模型,大鼠去卵巢及糖皮质激素骨质疏松症双模型的预防效果。 方法:将在第三章实验一中已随机分组的30只41周龄SD雌性大鼠予以降钙素皮下注射4mg/kg/d,其分别是:降钙素干预去卵巢大鼠组(OVX+C组);降钙素干预甲泼尼龙注射大鼠组(PRED+C组);降钙素干预去卵巢+甲泼尼龙注射大鼠组(OVX+PRED+C组),每组10只大鼠。其他实验方法和统计学处理同第三章实验一。 结果:降钙素干预的三组体重与对应的非干预组比较,体重有降低的趋势,子宫重量和子宫系数无明显变化。右侧胫骨灰重和全身骨密度在各组间无有意义的显著性改变。 1、离体骨骨密度: 在腰椎,降钙素干预各组与对应的非干预组之间, BMD、BMC、AREA无显著差异。 在股骨,OVX+C组与OVX组比较,整体股骨、FROI-1的BMD、BMC; FROI-2的BMD; FROI-5、6的BMC显著降低。在PRED+C组,其FROI-1、2的BMD显著低于PRED组和SHAM组,其他区域BMD,BMC无显著差异。在OVX+PRED+C组,整体股骨BMD仍显著低于SHAM组,但是与OVX+PRED组比较,股骨整体,FROI-1、2的BMD显著增加,而且FROI-1、2区域恢复到接近SHAM组水平。 在胫骨,OVX+C组胫骨整体和TROI-1的BMD、BMC显著低于SHAM组,整体胫骨BMC显著低于OVX组;PRED+C组各个骨骼区域和SHAM组、PRED组比较,无显著差异性;OVX+PRED+C组,整体胫骨BMD显著低于SHAM组,FROI-1、2区的BMD和FROI-1区的BMC显著高于OVX+PRED组。 2、骨组织计量学分析表明:降钙素干预后,三组的骨小梁微结构指标均得到了改善,甚至部分优于SHAM组。OVX+C组与OVX组比较,BV/TV增加了111.95%,Tb.Sp降低了55.41%,Tb.N增加了62.20%, Tb.Th、BFR、MAR显著降低;与SHAM组比较,BV/TV显著性增加13.16%。PRED+C组与PRED比较,BV/TV、Tb.Th、Tb.N分别增加了70.60%、27.23%、39.30%,并且Tb.Sp降低了39.70%,BV/TV比SHAM组也显著性增加。OVX+PRED+C组与OVX+PRED比较,BV/TV、Tb.Th、Tb.N分别增加了142.91%、20.59%、99.06%,Tb.Sp降低了66.46%,各指标与SHAM组比较均无显著差异。 3、uCT测定大鼠胫骨近端骨微结构参数分析表明,降钙素干预后,三组的骨小梁微结构指标均得到了改善。OVX+C组较OVX组骨小梁数目有增加,间距变小。PRED+C组与PRED组比较,骨小梁明显增厚,分布规则,与SHAM组比较,无明显区别;。OVX+PRED+C组与OVX+PRED组比较,骨小梁数目明显增加,厚度明显增加,分布较规则,未见明显的空洞;与SHAM组比较,骨小梁间距稍宽,分布稍不规则。 4、骨力学性能在降钙素干预后有一定改善。OVX+C组大鼠股骨干三点弯曲实验各参数与OVX组、SHAM组大鼠之间无明显差异;在压缩实验中,最大载荷、弹性模量较OVX组大鼠明显改善,但最大载荷仍没有恢复到假手术组水平。PRED+C组的股骨干及第二腰椎椎体最大载荷较PRED组显著改善(P0.01)且与SHAM组无明显差异(P0.05),其他力学参数有一定改善但是无显著性差异。OVX+PRED+C组与OVX+PRED组比较,股骨干弹性应力和椎体弹性模量有显著改善,其他参数虽然有一定的改善但仍无显著性差异。 结论: 1、降钙素减轻大鼠体重。 2、降钙素对于不同骨质疏松症大鼠模型以及同一模型的不同骨骼区域的骨量影响有显著差异。降钙素进一步降低了去卵巢大鼠的骨量,对糖皮质激素大鼠的骨量影响不显著,可以部分改善去卵巢+糖皮质激素性骨质疏松症大鼠模型的骨量丢失。 3、降钙素可以有效预防去卵巢骨质疏松症大鼠模型、糖皮质激素性骨质疏松症大鼠模型和去卵巢+糖皮质激素性骨质疏松症大鼠模型等三种动物模型的骨小梁丢失,同时使部分骨小梁得以重建。 4、降钙素更明显的作用于松质骨而不是皮质骨。 5、降钙素可以使去卵巢骨质疏松症大鼠模型、糖皮质激素性骨质疏松症大鼠模型和去卵巢+糖皮质激素性骨质疏松症大鼠模型等三种动物模型的生物力学性质得到部分改善。 6、降钙素主要是通过改善骨微结构而降低骨折率 第五章:降钙素预防骨质疏松症机制的初步研究 目的:观察各因素干预后成骨细胞和破骨细胞数量和活性的改变,初步探讨骨质疏松症发生的机制和降钙素预防骨质疏松症的机制 方法:取左侧股骨远端固定,脱钙后制成石蜡切片,使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术标记凋亡的成骨细胞和破骨细胞;腹主动脉采血处死动物后,离心得到血清,使用酶联免疫分析法检测血清中的骨形成指标:骨特异性碱性磷酸酶、骨钙素和血清I型胶原C端肽。 结果 1、各组成骨细胞和破骨细胞凋亡活性检测表明:成骨细胞的凋亡细胞指数在其余各组均明显高于SHAM组,干预组与对应的非干预组比较成骨细胞的凋亡细胞指数无显著性差异。破骨细胞的凋亡细胞指数,在行卵巢切除术的各组(OVX组、OVX+PRED组、OVX+C组、OVX+PRED+C组)均明显低于SHAM组,而PRED组、PRED+C组与SHAM组之间无明显变化,干预组与对应的非干预组在破骨细胞的凋亡细胞指数中无显著性差异。 2、各组大鼠血清钙磷和骨代谢生化指标的变化 血清钙离子水平(Ca)在OVX组、OVX+PRED组、OVX+C组、OVX+PRED+C组明显低于SHAM组,OVX+PRED组也明显低于PRED组而与OVX差异不明显。干预组钙离子水平明显低于对应的非干预组。血清磷离子水平在OVX组、OVX+PRED组、OVX+C组、PRED+C组、OVX+M+C组明显低于SHAM组,OVX+PRED组也明显低于PRED组而高于OVX组。降钙素干预后,OVX+C组、OVX+PRED+C组磷离子水平明显低于对应的非干预组而PRED+C组磷离子水平明显高于PRED组。 骨特异性碱性磷酸酶(Bone-specific Alkaline Phosphatase, ALP-B)在行去卵巢术的各组明显高于SHAM组,在PRED+C组明显低于SHAM组而PRED组与SHAM组比较则没有明显变化,干预组骨特异性碱性磷酸酶水平明显低于对应的非干预组。骨钙素(Osteocalcin,BGP)水平在在行去卵巢术的各组明显高于SHAM组,在PRED组、PRED+C组明显低于SHAM组。OVX+PRED+C组骨钙素水平明显低于OVX+PRED组,而另两组干预组与对应的非干预组之间区别不显著。血清Ⅰ型胶原C端肽(Serum Collagen-type-ⅠC-telopeptides, CTX-Ⅰ)在OVX组、OVX+PRED组、OVX+C组、PRED+C组、OVX+PRED+C组均比SHAM组明显增高。OVX+C组和SHAM+PRED+C组明显高于对应的非处理组,OVX+PRED+C组比OVX+PRED组有增高的趋势,但没有差异显著性。 结论: 1:各种因素干预后,成骨细胞和破骨细胞的数目和活性的变化趋势不成正比。 2:雌激素缺乏,使成骨细胞活性和破骨细胞活性增加,成骨细胞凋亡指数代偿性升高,骨吸收过度导致骨质疏松症的发生。糖皮质激素使成骨细胞活性降低,凋亡增加,以抑制骨形成为主。两因素共同作用对骨形成和骨吸收都有严重影响。 3:降钙素对成骨细胞和破骨细胞之间的偶联及成骨细胞的数目和功能没有明显的影响,不引起破骨细胞的凋亡,而是抑制其活性。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R580

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【二级引证文献】
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【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【相似文献】
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中国重要报纸全文数据库 前10条
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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10 周琳娜;雌激素替代对去卵巢大鼠小脑树突棘素和δ连环素表达的影响[D];华中科技大学;2006年
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