收藏本站
《中南大学》 2011年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

靶向Stathmin的siRNA与紫杉醇联合作用于鼻咽癌细胞的效应及机制的研究

伍勇  
【摘要】:目的:微管是构成细胞骨架的主要组成成分之一,其对于细胞的各种主动运动至关重要,这包括细胞形态的改变、细胞的移动、染色体的分离和细胞的分裂等。细胞中各种微管结构和功能的差异决定于其亚细胞定位及其与之结合的微管结合蛋白。Stathmin就是一个已经明确的使微管失稳定的微管结合蛋白,它通过促使微管解聚和隔离组成微管的Tubulin亚基而使微管失稳定,多种激酶可以通过磷酸化和去磷酸化而使Stathmin蛋白的微管失稳定活性失活和活化。鼻咽癌是中国人群特有的高发肿瘤,EB病毒的感染与鼻咽癌的发生发展密切相关,EB病毒编码的潜伏膜蛋白LMP1是一个已经确认的瘤致蛋白质。前期的研究发现Stathmin是LMP1调控网络中的一个下游分子,LMP1可以通过多条通路调节Stathmin的磷酸化,使微管失稳定而促使细胞永生化、增强肿瘤细胞增殖、转移和侵袭。 siRNA是人工RNAi技术中一个重要小分子,其可以激发与之互补的目标mRNA的沉默。具有高特异性、高效率、可遗传等重要特性。本研究以期通过构建的靶向Stathmin的siRNA质粒沉默其蛋白质的表达,降低微管的解聚,增强微管的聚合,从而促使肿瘤细胞凋亡、抑制其增殖、转移和侵袭。 紫杉醇是作用于细胞微管的主要抗肿瘤药物之一,它通过促进微管聚合,抑制其解聚,保持微管稳定,抑制细胞有丝分裂,具有显著的放射增敏作用,有着与靶向Stathmin的siRNA类似的作用。因此,本研究拟通过二者联合应用以期放大它们对肿瘤细胞的生物学效应。 方法:本文以鼻咽癌细胞CNE1-LMP1为研究模型,用本实验室构建的靶向Stathmin的siRNA质粒为策略,探讨靶向Stathmin的siRNA抑制其蛋白质的表达而对鼻咽癌细胞的凋亡和增殖、侵袭和迁移的影响,并评价Stathmin的siRNA与抗微管化疗药物联合应用的效应。 本研究首先以RT-PCR和Western blot证实本研究所应用的靶向Stathmin的siRNA质粒可否抑制鼻咽癌细胞CNE1-LMP1的Stathmin的mRNA和蛋白质的表达水平。以MTT实验证实靶向siRNA对鼻咽癌细胞生长增殖的抑制作用。利用流式细胞术确定靶向Stathmin的siRNA诱导鼻咽癌细胞的凋亡、细胞周期和线粒体膜电位的改变,以AO/EB染色和TUNEL实验证实其对鼻咽癌细胞凋亡的诱导作用,以Western blot检测siRNA转染后细胞凋亡标志性蛋白质Caspase的变化,以期确认鼻咽癌细胞的凋亡及凋亡途径。 其次,以Western blot检测转染靶向Stathmin的siRNA的鼻咽癌细胞中可溶性微管和聚合性微管比例的变化。以间接荧光染色检测该siRNA质粒对微管多聚化的调节作用。以划痕实验检测该siRNA对鼻咽癌细胞在二维平面上迁移能力的影响。以Transwell检测该siRNA对鼻咽癌细胞在三维基质中迁移和侵袭能力的调节。 再次,以MTT实验检测转染靶向Stathmin的siRNA和紫杉醇联合应用对鼻咽癌细胞增殖作用的影响。以流式细胞术检测二者联合应用对细胞的促凋亡作用和细胞周期的改变。以间接荧光法和Western blot检测转染该siRNA和紫杉醇联合应用对鼻咽癌细胞微管产生影响。 最后,以RT-PCR和Western blot检测紫杉醇对鼻咽癌细胞以及其它多种高表达Stathmin细胞A375、MGC和Hela中Stathmin表达在mRNA和蛋白水平的调节作用。 结果:首先,RT-PCR和Western blot实验证实了本研究所用的靶向Stathmin的siRNA质粒可以明显抑制鼻咽癌细胞Stathmin的mRNA和蛋白质表达水平。MTT实验检测细胞的生长曲线显示该siRNA的转染对鼻咽癌细胞的增殖也有明显的抑制作用。流式细胞术分析显示该siRNA可明显促进鼻咽癌细胞的凋亡(达到30.9%),使肿瘤细胞阻滞于G2/M期(16.3%)。同时,AO/EB染色、TUNEL实验以及Western blot检测凋亡标志性蛋白Caspase-3、8和9也进一步证实该siRNA对细胞凋亡的促进作用。并且,Caspase和线粒体膜电位的检测也明确该siRNA是通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡的。 其次,Western blot证实向鼻咽癌细胞转染靶向Stathmin的siRNA可明显增加细胞的聚合性微管的量而减少可溶性微管,使得聚合性微管/可溶性微管的比值明显提高(P/S=3.43);间接免疫荧光也显示转染siRNA的细胞微管长而成束,荧光强度明显提高。虽然二维的划痕实验并没有显示转染了该siRNA的鼻咽癌细胞运动能力有明显的改变,但Transwell实验显示转染该siRNA的细胞迁移和侵袭能力都受到明显抑制。 再次,将靶向Stathmin的siRNA质粒和紫杉醇联合应用于鼻咽癌细胞CNE1-LMP1。MTT实验显示联合应用对细胞增殖的抑制效果明显高于其中任何一种方式的单独应用。而且,转染了该siRNA的细胞,其细胞增殖的受抑制的程度与紫杉醇在一定的浓度范围内有剂量关系。间接免疫荧光实验同样显示虽然二者单独应用都可以一定程度上使被处理的细胞微管变粗和变长,荧光强度有所增强,但二者联合应用的结果显示出微管变得更粗和更长,荧光强度更强。同样,Western blot检测细胞的可溶性和聚合性微管的量也显示虽然二者单独应用都可以一定程度上使被处理细胞的聚合性微管增加,可溶性微管减少,聚合性微管/可溶性微管的比值有所增加。但二者联合使用,细胞中的聚合性微管增加和可溶性微管减少的程度要明显的多,聚合性微管/可溶性微管的比值显著提高(P/S=2.05)。 最后,研究还发现在鼻咽癌细胞以及其它多种高表达Stathmin的肿瘤细胞中,紫杉醇对细胞中的Stathmin表达有明显的抑制作用,而且,在鼻咽癌细胞中,这种抑制作用与紫杉醇的浓度有一定的剂量效应。 结论:靶向Stathmin的siRNA通过抑制其蛋白质的表达而抑制鼻咽癌细胞的增殖,迁移和侵袭,并通过线粒体途径促进细胞凋亡。这种对鼻咽癌细胞凋亡和增殖,迁移和侵袭的调控是通过增强微管的聚合而减少其降解,使微管多聚化、使微管稳定而实现的。紫杉醇可下调Stathmin的表达,靶向Stathmin的siRNA与化疗药物紫杉醇对鼻咽癌细胞有联合治疗效应。这将为鼻咽癌临床的化学治疗提供了一条新的启示。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R739.63

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张惠中,高萍,闫露,林芳;Stathmin基因在人成骨肉瘤细胞中的表达及意义[J];癌症;2004年05期
2 沈扬;梁立治;洪明晃;熊樱;魏梅;朱孝峰;;微管相关蛋白LC3和自噬基因Beclin1在上皮性卵巢癌中的表达及其意义[J];癌症;2008年06期
3 王峰;王留兴;何伟;朱利楠;赵培荣;樊青霞;;Stathmin基因在食管鳞癌中的表达及生物学意义[J];南方医科大学学报;2010年07期
4 王世卿;;紫杉醇类化合物抗肿瘤作用机制研究[J];淮海医药;2008年04期
5 易红;程爱兰;黄卫国;张鹏飞;李茂玉;彭芳;李峰;李萃;陈主初;肖志强;;应用激光捕获显微切割和蛋白质组学技术筛选鼻咽癌的差异表达蛋白质[J];中南大学学报(医学版);2008年05期
6 曹兰琴;林秋华;黎欣;张怡;李萃;李新国;;紫杉醇对人宫颈癌细胞系HCE1影响的蛋白质组学[J];中南大学学报(医学版);2008年06期
7 黄洁;严文华;吕海涛;孙凌;徐秋琴;;自噬基因Beclin-1和微管相关蛋白LC3在大鼠阿霉素心肌病中的表达及其意义[J];临床儿科杂志;2010年01期
8 张学聪;曹华;高冬玲;;stathmin基因在喉鳞状细胞癌组织中的表达及意义[J];临床耳鼻咽喉头颈外科杂志;2009年19期
9 韦朝霞;易咏红;孙卫文;苏涛;邓维意;廖卫平;;微管相关蛋白1B和突触素Ⅰ在FMR1基因敲除小鼠脑组织中的表达及相关性[J];实用医学杂志;2008年14期
10 陈惠萍;薄基膜肾病[J];肾脏病与透析肾移植杂志;2005年03期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 徐秀萍;张菊;施秀梅;;卵巢癌患者运用紫杉醇联合顺铂化疗的护理[J];当代护士(学术版);2010年12期
2 陈丽;那顺巴雅尔;张建;于娟;顾为望;;胡桃醌对人肝癌BEL-7402细胞亚显微结构的影响[J];南方医科大学学报;2009年06期
3 万保罗;董俊华;王琳;孔维佳;;Beclin1在喉鳞状细胞癌中的表达及其意义[J];中国耳鼻咽喉头颈外科;2011年04期
4 韩平;俞萍;陈可爱;林栋;张学君;吴强;;针刺长强穴对FMR1基因敲除小鼠海马CA1区BDNF和SYN表达的影响[J];福建中医药大学学报;2012年05期
5 孙瑜;徐立红;;MAPK信号通路对细胞骨架调控作用的研究进展[J];癌变·畸变·突变;2013年03期
6 王潇;樊青霞;赵培荣;王峰;;微管不稳定蛋白Stathmin在食管鳞癌组织中的表达及意义[J];肿瘤基础与临床;2007年05期
7 彭芳;汤参娥;李茂玉;李萃;程爱兰;李峰;张鹏飞;李美香;肖志强;陈主初;;应用激光捕获显微切割技术纯化的鼻咽癌蛋白质表达谱的建立[J];中南大学学报(医学版);2009年06期
8 魏瑞;谢云;杨丁懿;贺礼理;彭芳;申良方;;人耐药肺腺癌A549/DDP细胞株的差异蛋白质组学[J];中南大学学报(医学版);2010年08期
9 杨惠军;黄彦勤;李婉丽;;儿童急性淋巴细胞白血病beclin-1的表达及意义[J];湖南师范大学学报(医学版);2011年01期
10 万保罗;董俊华;王琳;李林冬;刘飞;臧艳姿;杨彩荣;;喉癌组织LC3转录水平的表达及其意义[J];河南医学研究;2011年04期
中国重要会议论文全文数据库 前4条
1 王鸿丽;刘洲禄;李卫华;赵永强;刘炳玉;李萍;薛燕;刘锋;何昆;张学敏;杨松成;;小儿肾上腺神经母细胞瘤及瘤旁组织的蛋白质组学分析[A];2008年全国有机质谱学术会议论文集[C];2008年
2 孙宇婷;石伟;;紫杉醇和多烯紫杉醇抗肿瘤作用的研究进展[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年
3 孙宇婷;石伟;;紫杉醇和多烯紫杉醇抗肿瘤作用的研究进展[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
4 倪宏;巩勇;陶陆阳;;新生期大鼠反复惊厥后海马LC-3的表达及干预[A];《中华急诊医学杂志》第八届组稿会暨急诊医学首届青年论坛论文汇编[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 佟庆;归术益坤汤治疗多囊卵巢综合征的临床与实验研究[D];北京中医药大学;2011年
2 陶帮宝;Stathmin在胶质细胞瘤表达及其化疗药物敏感性研究[D];第二军医大学;2011年
3 李楠;Sival抑制EMT及肿瘤转移的分子机制研究[D];中国科学技术大学;2011年
4 徐建萍;慢病毒介导STMN1基因沉默对白血病K562细胞及其耐药株生物学特性影响及机制研究[D];福建医科大学;2011年
5 刘飞;食管癌差异表达蛋白的分离鉴定及功能研究[D];北京协和医学院;2011年
6 王建丽;驱动蛋白Kif2a在乳腺癌中表达的临床意义及功能研究[D];山东大学;2011年
7 徐晓恩;以同一病人来源的系列乳腺细胞系研究乳腺癌致病的蛋白质基础[D];复旦大学;2011年
8 韩平;针刺长强穴治疗MR认知功能临床观察与突触可塑性研究[D];福建中医药大学;2011年
9 孙瑜;微囊藻毒素LR对肝细胞系HL7702内的蛋白磷酸酶PP2A下游靶点的影响[D];浙江大学;2012年
10 江培洲;EBV与TPA分别及协同处理CNE2细胞诱导基因表达差异的蛋白质组学研究[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王玉侠;Beclin-1基因和蛋白在卵巢子宫内膜异位症中表达的研究[D];安徽医科大学;2010年
2 吴瑞花;Beclin1、PTEN在子宫颈鳞癌中的表达、相关性及意义[D];山西医科大学;2011年
3 曹军;胡桃醌体外抗胰腺癌细胞机制的初步研究[D];山西医科大学;2011年
4 刘婷婷;墓头回提取物作用白血病K562细胞的蛋白质双向电泳技术的建立[D];兰州大学;2011年
5 吴亮亮;胃癌组织中Stathmin的表达及其临床意义[D];天津医科大学;2011年
6 吕艳琦;儿童急性淋巴细胞白血病细胞差异蛋白质组学分析[D];郑州大学;2011年
7 王娟;肝细粒棘球蚴周围纤维囊壁形成机制的初步探索[D];石河子大学;2011年
8 宋银峰;壳聚糖-pGU6/GFP/Neo-shSTA纳米粒沉默stathmin基因对肺腺癌细胞化疗敏感性的影响[D];华中科技大学;2010年
9 石英;Stathmin/Op18在卵巢癌中的表达及对顺铂敏感性影响的研究[D];华中科技大学;2011年
10 程超;ENO1基因在鼻咽癌发病中的作用研究[D];南方医科大学;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李培建,李兵仓;一种重组腺病毒载体的扩增、纯化和病毒滴度检测方法[J];中华神经医学杂志;2002年01期
2 范熙明,张惠中,张明华,范清宇;Stathmin基因反义核酸对人成骨肉瘤细胞系的生长抑制作用[J];第四军医大学学报;2002年05期
3 曲建波,张惠中,马保安,范清宇,张正旭;成骨肉瘤组织中stathmin基因的表达意义[J];第四军医大学学报;2002年07期
4 何国庆;徐晋;裴荣;张杰武;;p21活性蛋白激酶在喉癌和喉咽癌中的表达及临床意义[J];中国耳鼻咽喉头颈外科;2006年08期
5 黄泽亮,周曦,陈忠东,郑大伟,张少宏,关午;紫杉醇诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及对端粒酶活性的影响[J];中国妇产科临床杂志;2005年03期
6 王赞宏;李莉;;自噬与肿瘤[J];国外医学(妇产科学分册);2007年06期
7 吴尚辉,祝和成,顾焕华,黄柏英,刘华英;宫颈癌细胞系HCE_1的建立及其生物学特性[J];湖南医科大学学报;2000年06期
8 姚开泰;鼻咽癌研究的回顾与展望(纪念湖南医科大学80周年校庆)[J];湖南医科大学学报;1995年02期
9 曹学全;张红;娄欣;孙淼淼;高冬玲;张岚;宋一民;陈奎生;;食管鳞癌组织中Syndecan-1蛋白及mRNA表达[J];郑州大学学报(医学版);2007年01期
10 陈乐真,黄靖香,游联璧,李红芬;人喉腺泡型横纹肌肉瘤细胞系(PLA-802)的建立及其生物学特性[J];解放军医学杂志;1983年04期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 叶东;张海峰;朱林燕;王立伟;陈丽新;;ClC-3 siRNA抑制鼻咽癌细胞调节性容积回缩[J];南方医科大学学报;2011年02期
2 李继霞,周克元,蔡康荣,梁统,唐旭东,张月飞;利用RNA干扰效应阻抑鼻咽癌细胞bcl-xL基因表达和诱导癌细胞凋亡的研究[J];中华耳鼻咽喉科杂志;2005年05期
3 梁树辉,丁杰,黄大伟,潘阳林,林涛,党冬梅,时永全,吴开春;胃癌细胞AGS中KDR的表达对人脐静脉内皮细胞生物学行为的影响[J];现代肿瘤医学;2005年02期
4 倪勤;RNA干扰技术防治病毒性肝炎的研究[J];国外医学.流行病学.传染病学分册;2003年04期
5 李光明,谢青,史毅,李定国,金由辛;siRNA对HSC结缔组织生长因子的抑制作用[J];上海第二医科大学学报;2005年02期
6 燕春艳;RNA干扰技术研究进展[J];实用医药杂志;2003年09期
7 马鹏鹏,葛晔华,郭睿,马静,陈平,薛社普,韩代书;小分子干扰RNA(siRNA)表达载体沉默靶基因的研究[J];解剖学报;2004年06期
8 郭述良,罗永艾;RNA干扰及其在呼吸系统疾病研究中的应用[J];国外医学.内科学分册;2004年12期
9 赵洪波,张嘉宁;RNA干扰技术的应用[J];大连医科大学学报;2003年04期
10 范怡敏,耿飞,吴兴中;RNAi的机制及RNAi技术的应用[J];医学综述;2004年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 邓清华;刘国文;刘磊;王建国;朱晓岩;李小兵;王哲;;siRNA特异性抑制犊牛原代肝细胞SREBP-1c基因的表达[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会第七届代表大会暨学术研讨会论文集(上册)[C];2011年
2 季爱民;苏丹;车鸥;李文适;孙靓;张忠义;杨彬;;壳聚糖/siRNA纳米粒介导的功能性基因沉默研究(英文)[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
3 黄伟;吕明;金明姬;杨长青;高钟镐;;mPEG-PCL-g-PEI聚合物的合成及其siRNA递送性能[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
4 陈宇;郑海涛;杨力建;陈少华;沈琦;刘思初;李萡;李扬秋;;靶向抑制PPP2R5C基因的siRNA的筛选[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
5 刘政;邱广斌;;MYCT-1基因特异的siRNA对GES-1细胞凋亡、增殖及细胞周期的影响[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
6 陈卫华;王跃闽;;Cb1-b特异性siRNA载体的筛选验证[A];华东六省一市泌尿外科学术年会暨2011年浙江省泌尿外科、男科学学术年会论文汇编[C];2011年
7 刘芳蕾;周勇;应可净;;肺癌PLK1基因多态性及siRNA干预的研究[A];2011年第三十三届浙江省呼吸系病学术年会暨呼吸疾病诊治新进展学习班论文汇编[C];2011年
8 薛利军;曹明媚;秦照玲;潘欣;戚中田;;siRNA抑制结核分枝杆菌侵袭相关基因mcela在体外培养的人细胞内的表达[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
9 章如新;;P物质siRNA在变应性鼻炎中的作用机制研究[A];世界中联耳鼻喉口腔专业委员会换届大会及第三次学术年会暨中华中医药学会耳鼻喉科分会第十七次学术交流会暨广东省中医及中西医结合学会耳鼻喉科学术交流会论文汇编[C];2011年
10 李平;刘苹;陈星云;赵艳;彭艳;陈磊;周元国;;大鼠c-ski基因siRNA真核表达载体的构建及其在成纤维细胞中的干扰效果观察[A];重庆市生物化学与分子生物学学术会议论文摘要汇编[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 余志平;打开功能基因组学与未来治疗学的大门[N];中国医药报;2004年
2 庄北宁;防治非典,专家称找到基因“新药”[N];新华每日电讯;2005年
3 杨霞;防治SARS药研发获阶段性成果[N];中国医药报;2004年
4 聂翠蓉编译;RNAi:生物技术的蓝月亮[N];科技日报;2003年
5 朱珍建;环境,癌症的诱因[N];中国商报;2001年
6 曾崇君;奇尔根核酸业务试水MBO[N];医药经济报;2004年
7 本报特约撰稿人 陆志城;RNA干扰技术遭遇“缺陷危机”[N];医药经济报;2003年
8 记者 毛黎;美开发出癌症治疗新技术[N];科技日报;2009年
9 张荔子;乳腺癌基因特异性药物曙光初现[N];健康报;2004年
10 杨霞;广东SARS防治药物研究取得阶段成果[N];中国医药报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 伍勇;靶向Stathmin的siRNA与紫杉醇联合作用于鼻咽癌细胞的效应及机制的研究[D];中南大学;2011年
2 胡平方;纤溶酶原激活物抑制剂-1 siRNA治疗实验性肝纤维化[D];第二军医大学;2010年
3 蔡磊;携带Survivin特异性siRNA的完全人源性肝癌单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白对肝癌凋亡的影响研究[D];第四军医大学;2010年
4 张伟;H5N1亚型高致病性禽流感病毒siRNA靶向制剂的研究[D];中国协和医科大学;2010年
5 郭炬;siRNA靶向沉默HPA基因对人膀胱癌BIU-87细胞的生物学及HPA相关基因的影响[D];华中科技大学;2011年
6 徐向上;Aptamer-protamine-siRNA复合物在肿瘤靶向治疗中的作用研究[D];华中科技大学;2010年
7 韩璐;豆科植物蒺藜苜蓿发育相关基因[D];山东大学;2010年
8 王哲文;后发性白内障的发病机制研究[D];吉林大学;2006年
9 向飞宇;心衰的机制与干细胞治疗基础研究[D];复旦大学;2009年
10 张彦萍;纤溶酶原激活物抑制剂-1siRNA抗博来霉素诱导的大鼠肺纤维化作用及机制[D];河北医科大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王涵;应用siRNA技术下调Survivin抑制鼻咽癌细胞生长的研究[D];昆明医学院;2010年
2 郑亚婷;应用siRNA技术抑制铜绿假单胞菌外膜蛋白OprM表达的研究[D];昆明医学院;2010年
3 贾丽洁;ICP27特异性siRNA抑制HSV-1病毒复制的实验研究[D];郑州大学;2010年
4 付振宇;siRNA沉默HIF-1α基因对人前列腺癌PC3细胞生物学性状的影响[D];苏州大学;2010年
5 韦德芳;利用pSOS-HUS系统筛选靶向乙肝病毒X基因的siRNA的研究[D];重庆医科大学;2010年
6 马婧薇;ASGPR介导的靶向siRNA抑制HBV的复制与表达[D];华中科技大学;2009年
7 方首镕;siRNA干扰MDR1逆转舌癌耐药性表型的实验研究[D];广西医科大学;2011年
8 李杰;抑制PKM2的siRNA协同抑制CCND1的作用机制研究[D];安徽医科大学;2011年
9 索涛莉;靶向Hsp90β siRNA对Jurkat细胞生长抑制及化疗敏感性影响的研究[D];重庆医科大学;2010年
10 汤容;siRNA抑制人卵巢癌SW626细胞CXCR4基因的研究[D];重庆医科大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026