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《中南大学》 2011年
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UV诱导HLEC凋亡的细胞及分子机制的实验研究

贾松柏  
【摘要】:目的 用不同剂量紫外线(Ultraviolet, UV)照射体外培养人晶状体上皮细胞(Human lens epithelial cell, HLEC)通过对HLEC凋亡凋亡调控基因(Bax、Bcl-2)、细胞周期及ALDH,蛋白表达变化的观察,探讨紫外线诱导HLEC凋亡的细胞及分子生物学机制。方法 本试验以实验室培养的HLEC细胞株为研究模型,采用同一紫外线光源(UVA照度为0.29mw/cm2,UVB照度为0.09 mw/cm2),对HLEC进行照射。按UV照射时间将HLEC分为Omin、5min、10min、15min及30min组,UV照射后HLEC放回二氧化碳培养箱继续培养12小时后再进行各项检测。 1.UV诱导HLEC凋亡的检测:采用Hoechst 33342染色、琼脂糖凝胶电泳对HLEC凋亡进行定性检测;AO-EB染色及Annexin-V +PI双染流式细胞计数对HLEC凋亡进行定量检测,并分析UV照射剂量与凋亡率间的关系。 2.UV照射诱导HLEC凋亡基因的表达及细胞周期的变化:用原位杂交的方法检测各组Bax、Bcl-2 mRNA表达,流式细胞术检测细胞周期的变化。 3.UV照射对HLEC内ALDH1蛋白表达的影响:用免疫组化的方法观察ALDH1在对照组及各实验组的表达,用Western Blot对其蛋白含量进行测定。结果 1.UV照射与HLEC凋亡:Hoechst 33342染色及AO-EB染色UV处理后各实验组HLEC均有凋亡特征性形态改变,如细胞质浓缩,细胞核致密浓染或呈碎块状形成凋亡小体等。琼脂糖凝胶电泳法检测除5min组外其余各组都出现DNA ladder,上述三种方法定性证实UV可诱导HLEC凋亡。AO-EB染色法检测HLEC凋亡率在Omin、5min、l0min、15min、30min组分别为1.82±0.53%、13.15±2.32%、17.58±1.62%、31.16±3.03%、29.25±2.53%(F=146.10,P0.05)。Annexin-V+PI双染流式细胞计数检测以上各组凋亡率分别为1.98±0.84%、11.90±3.21%、16.15±3.05%、33.93±3.74%、22.72±6.05%(F=34.16,P0.05)。两种方法定性分析均表明随UV照射时间的延长凋亡率增加。 2.UV照射与Bax上调和Bcl-2下调:随UV照射时间延长,Bcl-2阳性细胞率逐渐降低,而Bax阳性细胞率逐渐增加。经配对资料T检验,组与组间差异有显著性(P0.05)。HLEC凋亡率与Bcl-2/Bax比率呈负相关(r=-0.874,P0.05)。 UV照射与HLEC细胞周期阻滞:各实验组G2/M期细胞与Omin组比较差异有显著性(P0.05),但各实验组间差别无显著性(P0.05);经单因素方差分析,S期细胞随UV照射时间延长逐渐减少(F=40.34,P0.05)。 3.UV照射与ALDH1:ALDH1免疫组化染色阳性细胞率在Omin、5min、10min、15min及30min组分别为39.23±5.34%、30.57±4.45%、17.91±4.28%、10.25±3.01%、3.83±0.83%,各组阳性细胞率的两两比较除Omin组与5min组间差异无显著性外(P0.05),其余各组间两两比较差异均有显著意义(P0.05);ALDH1免疫组化染色阳性细胞率随着UV照射时间延长而降低(F=68.827,P0.05);Western blot灰度比值随UV照射时间延长逐渐下降(F=17.256,P0.05)。结论 1.UV照射可诱导HLEC凋亡,凋亡率在一定时间内与UV照射剂量和时间呈正相关。 2.UV照射可诱导HLEC凋亡调控基因Bax上调和Bcl-2下调。 3.UV照射可诱导HLEC细胞周期阻滞,与剂量呈正相关。 4.UV可导致HLEC内ALDH1含量下降。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R363

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