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《中南大学》 2010年
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阿尔茨海默病脑内老年斑形成及机制探讨

蔡艳  
【摘要】:第一部分BACE-1在AD病脑组织中的表达 目的:观察BACE-1在正常及阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)时的空间表达模式。 方法:收集AD或痴呆病史超过3年的病人17例,非痴呆病人14例,不同年龄(22-34岁)恒河猴7只。首先运用尼氏染色、bielschowsky银染、免疫组织化学及western blot等方法对所收集材料进行病理诊断及分组。进而对各组脑进行p-位点APP剪切酶-1(β-site APP cleavage enzyme-1, BACE-1)免疫组织化学检测,观察BACE-1在正常和异常脑内的空间表达模式。 结果:尼氏染色结果显示为结构清晰的人脑组织,老年斑和p-Tau同时存在者为AD实验组,二者均不存在者为非AD对照组。按以上标准分别将恒河猴分为老年组及正常组。分组结果显示AD实验组和非AD对照组分别有7例,恒河猴老年组3例,正常组4例。Western blot结果显示,AD实验组p-Tau、淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)、不同分子量BACE-1及其β位点剪切产物的蛋白表达相对于非AD对照组均有明显增加;恒河猴老年组脑内不同分子量BACE-1蛋白含量显著高于正常组。BACE-1免疫组织化学染色结果显示,非AD对照组及恒河猴正常组BACE-1的表达模式与正常小鼠相似,即最强表达在嗅球及海马苔藓纤维,脑皮质内则主要分布在神经毡内,表现为弱的类似背景染色。AD实验组及恒河猴老年组脑内BACE-1表达出现异常上调,表现为大小不一、形状各异的斑块样结构。 结论: BACE-1的异常表达增加可能参与了AD及老年恒河猴脑内淀粉斑的形成 第二部分BACE-1上调与Aβ沉积以及失营养性轴突病变之间的关系 目的:观察AD病人及AD样恒河猴脑内BACE-1上调与Aβ沉积以及失营养性轴突病变之间的关系,揭示AD时可能的老年斑形成过程。 方法:对各组邻片进行免疫组织化学DAB双标及免疫荧光双标观察其脑内BACE-1标记的失营养性神经突起与β淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ), APP、早老素(presenilin-1, PS1)等AD相关分子之间的时空关系。另通过BACE-1与突触囊泡素(synaptophysin, SYN)及微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein-2, MAP-2)的免疫双标确定失营养神经突起的性质。 结果:AD实验组免疫组织化学邻片结果显示脑内斑块少的样本BACE-1、Aβ空间上完全匹配,而斑块多的样本Aβ表达量明显高于BACE-1;恒河猴老年组免疫荧光双标结果显示异常表达增加的BACE-1定位于失营养性轴突末梢(BACE-1与SYN免疫共存),且与APP (BACE-1剪切底物)、PS1 (Aβ在γ位点的剪切酶)、Aβ等AD相关分子有免疫共存。肿胀轴突内表达上调的BACE-1与Aβ完全共存,轴突周围没有Aβ免疫阳性产物存在。随着肿胀轴突的进-步芽生长大,一些体积小的BACE-1免疫阳性神经突起簇周围可出现少量Aβ阳性产物,并随着神经突起簇的体积增大而增多。当BACE-1标记的失营养性神经突起形成大的玫瑰花瓣样结构时,其周围已有大量致密的Aβ阳性产物存在。 结论: 1.AD时过量产生的Aβ最初可能来源于失营养神经突起中的轴突成分; 2. BACE-1可能参与调节失营养性轴突产生过量Aβ。 第三部分BACE-1上调及淀粉斑形成的实验性机制探讨 目的:探讨神经元功能降低对Tg2576小鼠脑内BACE-1及老年斑形成的影响。 方法:随机获取6月龄Tg2576小鼠28只,制备左侧嗅觉功能剥夺模型以模拟AD时脑内低代谢状态,未剥夺侧(右侧)嗅球作为自身对照,存活至7、8、9、12、18、24个月。运用细胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase, CO)组织化学染色、免疫组织化学、western blot、ELISA等形态学、分子生物学方法观察功能剥夺对Tg2576小鼠嗅觉中枢内BACE-1及淀粉斑形成的影响。 结果:邻片对比显示单侧嗅觉剥夺Tg2576小鼠嗅球及梨状皮质内BACE-1与CO表达相反,嗅觉剥夺侧相对于未剥夺侧BACE-1表达增加,CO则表达下降,提示模型制备成功。Western blot、β位点APP剪切酶活性测定和Aβ40. Aβ42的ELISA测定结果显示剥夺侧BACE-1、β位点APP剪切酶C末端剪切产物、Aβ40、Aβ42表达均高于未剥夺侧。BACE-1及Ap免疫组织化学染色邻片对比显示:随着年龄的增长Tg2576小鼠嗅球及梨状皮质内老年斑形成逐渐增多,且斑块最先出现在梨状皮质,然后累及嗅球。BACE-1与Aβ等免疫荧光双标结果显示Tg2576小鼠嗅球及梨状皮质内BACE-1表达在失营养性轴突末梢(BACE-1与SYN免疫共存),表达增加的BACE-1与Ap免疫共存,斑块形成过程类似于第二部分。 结论: 神经元的代谢功能降低可能是引起BACE-1上调继而形成老年斑的上游机制之一。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R749.16

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