异种松质骨—海藻酸钙-PLGA-大鼠BMP-2复合支架材料制备及其复合大鼠脂肪间充质干细胞体内成骨

【摘要】：第一章脂肪间充质干细胞的分离、培养及扩增 目的：探讨脂肪间充质干细胞的分离、培养及扩增的实验方法以及生物学特点。 方法：手术切取SD大鼠腹股沟脂肪组织,Ⅰ型胶原酶消化后离心得到细胞沉渣,以含10%新生牛血清的DMEM培养基培养、传代。通过倒置显微镜、Giemmsa染色、细胞计数、MTT、流式细胞术等方法研究细胞的形态、生长等生物学特性。 结果：分离培养的细胞贴壁生长,增殖迅速。流式细胞仪检测第6代细胞表面标志,结果显示95%的细胞表达CD29、96%的细胞表达CD44。 结论：从SD大鼠脂肪组织中分离培养的细胞具有干细胞生物学特点,可作为骨组织工程的种子细胞。 第二章SD大鼠脂肪间充质干细胞的成骨诱导 目的：探讨诱导SD大鼠脂肪间充质干细胞向成骨细胞增值分化的条件和特点,为脂肪间充质干细胞体内应用提供理论依据。 方法：用含有10%新生牛血清、地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、维生素D的高糖DEME作为成骨诱导剂,对第4代SD大鼠脂肪间充质干细胞进行成骨诱导分化后,通过倒置显微镜、Giemmsa染色观察成骨诱导后细胞的形态特征；通过Gomori改良钙钴法、碱性磷酸酶检测试剂盒检测细胞内碱性磷酸表达情况；通过茜素红s染色、四环素荧光标记检测是否有钙结节形成；通过RT-PCR检测骨钙素mRNA的表达情况；通过免疫组织化学染色、Western-blot检测工型胶原蛋白的表达情况。 结果：SD大鼠脂肪间充质干细胞经成骨诱导后,细胞体积增大,呈短梭形、多角形；碱性磷酸酶呈阳性表达；有钙结节形成；RT-PCR检测细胞骨钙素mRNA在280bp段发现目的条带；工型胶原蛋白阳性表达；Western-blot检测发现,随成骨诱导时间的延长,Ⅰ型胶原蛋白的表达逐渐增强。 结论：SD大鼠脂肪间充质干细胞经诱导后,可向成骨细胞分化和增值,且具有很强的成骨特性。 第三章异种松质骨-海藻酸钙-PLGA-大鼠BMP-2复合支架材料的制备 目的：制备一种可降解的可持续缓释BMP-2的复合支架材料。 方法：通过乳化法制取PLGA-大鼠BMP-2微球,用粒径分析仪分析PLGA-大鼠BMP-2微球的粒径分布,通过海藻酸钙凝胶将PLGA大鼠BMP-2微球包裹于异种松质骨的孔隙内,通过电镜观察复合支架材料的结构；通过ELISA检测复合支架材料的缓释情况,将复合支架材料的浸提液与脂肪间充质干细胞共培养,检测复合支架材料的生物相容性。 结果：PLGA-大鼠BMP-2微球呈圆形,粒径分布在120-450nm之间,异种松质骨孔隙相互连通,填充有海藻酸钙和PLGA-大鼠BMP-2微球,复合支架材料体外缓释平稳,于第8周时约有83%的BMP-2释放,复合支架材料浸提液与脂肪间充质干细胞共培养显示细胞生长良好,无明显细胞毒性。 结论：异种松质骨-海藻酸钙-PLGA-大鼠BMP-2复合支架材料具有良好的缓释功能,生物相容性好,可作为骨组织工程的支架材料。 第四章异种松质骨-海藻酸钙-PLGA-大鼠BMP-2复合支架材料复合大鼠脂肪间充质干细胞体内成骨实验 目的：研究SD大鼠脂肪间充质干细胞复合异种松质骨-海藻酸钙-PLGA-大鼠BMP-2支架材料体内成骨的情况,为临床应用SD大鼠脂肪间充质干细胞复合异种松质骨-海藻酸钙-PLGA-大鼠BMP-2支架材料构建组织工程骨提供理论依据。 方法：取裸大鼠30只,分实验组和对照组,实验组背部肌袋植入异种松质骨-海藻酸钙-PLGA-大鼠BMP-2-脂肪间充质干细胞复合支架材料,对照组右侧背部肌袋植入异种松质骨-海藻酸钙-PLGA-脂肪间充质干细胞复合支架材料,左侧背部肌袋植入异种松质骨-海藻酸钙-PLGA复合支架材料,定期取材,通过HE染色、扫描电镜、X光照片、碱性磷酸酶检测等方式观察细胞-支架复合体体内成骨情况；5-溴脱氧尿嘧啶核苷免疫组织化学染色显示类骨质形成情况；通过ELISA检测复合支架材料BMP-2缓释情况。 结果：脂肪间充质干细胞粘附于异种松质骨-海藻酸钙-PLGA-大鼠BMP-2支架材料支架材料孔隙内。复合支架材料植入体内后定期取材,经HE染色、x光照片显示实验组和对照组的异种松质骨-海藻酸钙-PLGA-脂肪间充质干细胞组有新骨形成,且实验组成骨较明显,对照组异种松质骨-海藻酸钙-PLGA组无明显骨质形成,支架材料逐渐降解；实验组可检测到BMP持续释放；碱性磷酸酶检测显示实验组表达强于对照组；经5-溴脱氧尿嘧啶核苷免疫组织化学染色,实验组和异种松质骨-海藻酸钙-PLGA-脂肪间充质干细胞对照组呈阳性表达,证实类骨质来源于脂肪间充质干细胞。 结论：异种松质骨-海藻酸钙-PLGA-大鼠BMP-2支架材料是一种理想的支架材料,可用于骨组织工程；脂肪间充质干细胞具有骨向分化成骨能力,可作为骨组织工程的种子细胞。

【关键词】：脂肪间充质干细胞 组织工程 种子细胞 细胞培养 脂肪间充质干细胞 种子细胞 成骨诱导 组织工程 复合支架材料 BMP-2 海藻酸钙 PLGA 复合支架材料 BMP-2 海藻酸钙 PLGA 组织工程
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R318.08
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