三甲氧基二苯乙烯及其对非小细胞肺癌A549细胞的抗肿瘤作用及分子机制研究

【摘要】：研究背景 肺癌是我国发病率较高的恶性肿瘤,在恶性肿瘤死亡的前列,其中80%-85%为非小细胞肺癌,因此,探讨肺癌的发生、发展、浸润、转移的机制成为目前研究的热点。目前NSCLC的主要治疗包括手术、化疗、放疗和分子靶向等综合性治疗。大多数NSCLC患者就诊时已属晚期,失去了手术机会,化疗成为最主要的抗肿瘤治疗。白藜芦醇(3,4’,5-三羟基-反-均二苯代乙烯)是一种由植物合成的应对抗外来病原的多酚类化合物,已在多种植物中被发现。葡萄皮和红葡萄酒中白藜芦醇的含量较高,而白葡萄酒中的含量极低。因此,研究者认为白藜芦醇是“法国悖论”现象(尽管法国人同其他发达国家的居民一样,摄取了大量的高脂肪、高蛋白、高热量的食物,但他们的心血管病发病率却比其他发达国家低得多)发生的一种关键物质。研究显示,白藜芦醇具有调节脂质代谢、抑制血小板聚集、清除自由基、抗炎、抗肿瘤等多种生物学活性和药理作用。虽然白藜芦醇抗肿瘤的作用近年来已经成为一个研究热点,但是目前国内外尚无白藜芦醇在体内、体外环境下抗肿瘤活性的系统性研究报道,并且对于其抗肿瘤的机制也存在着多种观点。白藜芦醇衍生物和类似物(其中包括羟基类似物及甲基化和酯类衍生物等)与白藜芦醇一样具有多种生理药理活性,其中有些化合物的活性、选择性及稳定性均要强于白藜芦醇,故备受关注,成为近些年的研究热点。为了全面了解白藜芦醇的抗肿瘤活性,同时深入揭示其抗肿瘤作用的机制,进行了本项实验。在一些恶性肿瘤不仅发现NF-κB／Re 1基因结构的改变,而且发现其表达及活化水平的异常。大量的研究表明,NF-κB作为转录因子Rel家族的重要成员,在调节免疫反应、胚胎及细胞生长、细胞凋亡、细胞周期进展、炎症和肿瘤的形成中起着重要的作用。 为了确定三甲氧基二苯乙烯是否有抗非小细胞肺癌效应,本研究用三甲氧基二苯乙烯作用于A549细胞株,观察三甲氧基二苯乙烯对A549细胞是否具有增殖抑制、凋亡诱导和分化诱导作用；并对其分子机制进行探讨。 第一章三甲氧基二苯乙烯的结构鉴定 目的 对本实验药物TMS进行结构鉴定。 方法 用紫外吸收光谱检测、红外吸收光谱检测、1H-NMR谱检测、13C-NMR图谱检测、质谱检测等方法对TMS进行结构鉴定。 结果 TMS的紫外吸收图谱为λmax(MeOH):318nm,306.2nm,217.8nm,红外光谱解析为IRvKBrmax(cm-1):2999,2935,2836,1591,1511,1456,1H-NMR谱解析显示结构含有3个甲氧基,13C-NMR图谱解析为17个碳信号,并且其结构中含有对称的结构片段。质谱图谱解析为ESI-MSm/z：27 1[M+H]’,256[M+H-CH3],241[256-CH3]+,表明分子量为270,推测分子式为C17H18O3,结构中含有甲基。样品元素分析得分子结构式可用C17H18O3表示,结构式为因此可确定化合物为反-3,4’,5-三甲氧基二苯乙烯。 结论 TMS的分子结构式可用C17H18O3,表示结构式为是反-3,4’,5-三甲氧基二苯乙烯。 第二章三甲氧基二苯乙烯对非小细胞肺癌A549细胞的增殖抑制效应 目的 观察三甲氧基二苯乙烯对A549细胞细胞增殖的影响。 方法 用MTT试验、集落形成抑制试验A549细胞增殖能力,观察不同浓度的三甲氧基二苯乙烯对A549细胞增殖的抑制率、集落形成的影响。 结果 (1)三甲氧基二苯乙烯以浓度依赖性方式有效地抑制A549细胞增殖,三甲氧基二苯乙烯抑制A549细胞活力的工C50为8.6μmol/L；(2)三甲氧基二苯乙烯能显著抑制A549细胞集落形成,并呈量效关系； 结论 三甲氧基二苯乙烯能够有效地抑制A549细胞增殖,并呈药物浓度和时间依赖性。 第三部分三甲氧基二苯乙烯对A549细胞的凋亡诱导效应 目的 确定三甲氧基二苯乙烯能否诱导A549细胞凋亡。 方法 用不同浓度的三甲氧基二苯乙烯作用于A549,采用Hoches t33258染色法检测凋亡细胞的百分率；用Western印迹检测三甲氧基二苯乙烯干预后的A549细胞Caspas e一3蛋白质表达。 结果 (1) Hochest33258染色法证明三甲氧基二苯乙烯能以浓度依赖性方式诱导A549细胞凋亡；(2)三甲氧基二苯乙烯诱导A549细胞凋亡伴有Caspas e一3蛋白表达上调和裂解激活。 结论 三甲氧基二苯乙烯能以浓度依赖性方式诱导A549细胞凋亡；其诱导A549细胞凋亡的分子机制与Caspase一3蛋白表达上调和裂解激活有关。 第四章三甲氧基二苯乙烯对A549细胞增殖抑制和凋亡诱导效应的分子机制 目的 观察三甲氧基二苯乙烯作用下A549细胞增殖抑制和凋亡诱导过程中NF-κB、STAT3、STAT5b、及JAK2等增殖和凋亡相关蛋白表达水平的变化及NF-κB细胞内分布,部分揭示三甲氧基二苯乙烯抗A549细胞作用的分子机制。 方法 (1)用Western blot分析三甲氧基二苯乙烯作用下A549细胞NF-K B、I K B、STAT3、STAT5b、JAK2蛋白质表达水平,(2)用间接免疫荧光技术观察NF-κB在三甲氧基二苯乙烯干预的A549细胞中的定位及变化。 结果 三甲氧基二苯乙烯能以浓度依赖性方式抑制A549细胞NF-κB、STAT3、STAT5b、蛋白质的表达水平,可上调IKB蛋白质表达,但对JAK2蛋白无明显影响；NF-κB主要分布于细胞胞浆中。 结论 三甲氧基二苯乙烯的抗A549细胞作用与其抑制STATs和NF-KB信号转导途径有关。

【关键词】：三甲氧基二苯乙烯 A549细胞 非小细胞肺癌 增殖 凋亡 信号转导
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R734.2
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