蜈蚣提取液的分离纯化与治疗肝细胞性肝癌机制的研究

【摘要】：肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全世界最常见的恶性肿瘤之一,死亡率在癌症中占第三位,在亚洲和非洲平均每年100,000人中就有约50-150人死于HCC。近20年来,我国HCC的治疗尽管取得了长足的进步,早期诊断率、手术切除率、术后生存率及生存质量均有较大提高,但HCC的发病率和死亡率仍占癌症中的第二位。 治疗方法选择主要取决于肿瘤的分期及肝功能情况。手术切除(包括部分肝切除和肝移植)可能治愈小肝癌,而对进展期和转移性HCC疗效有限。对于不能手术切除或全身情况差不能耐受手术者,可采取肿瘤的局部和全身治疗相结合的方法。尽管目前治疗方法很多,但每种方法各有其局限性,对中、晚期HCC的疗效有限。故寻找有效的治疗药物是提高中、晚期HCC存活率及改善生活质量的重要手段,具有重要意义。 在我国,蜈蚣用于疾病的预防和治疗已有两千余年的历史。近年研究表明蜈蚣全虫提取液有多种作用,其抗肿瘤的效果亦有少量报道。为此,我们以肝癌细胞株Bel-7402为研究对象,采用分离纯化的蜈蚣提取液产物处理细胞,通过观察其对Bel-7402细胞的增殖及形态等的影响,进一步了解蜈蚣提取液治疗肝癌的效果并探讨其作用机制,为蜈蚣提取液临床治疗肝癌提供理论基础。 第一章蜈蚣蛋白质体外抗癌作用的研究 目的：提取ECP总液并将其分离为上清液和蛋白质,分别研究三者对肝癌细胞株Bel-7402增殖的抑制作用。 方法：体外培养肝癌细胞株Bel-7402,分别采用不同浓度ECP总液、上清液及蛋白质处理细胞,利用倒置光学显微镜观察Bel-7402细胞的形态变化,并通过MTT法研究肝癌细胞Bel-7402对它们的敏感性。同时体外培养正常肝细胞株L02,观察不同浓度ECP总液处理后,L02细胞形态学改变及对ECP总液的敏感性。 结果： ①光镜下和细胞计数结果示,ECP总液、ECP蛋白质和5-Fu作用48小时后,Bel-7402细胞数量减少明显,部分未坏死细胞形态变圆变小,而ECP上清液作用Bel-7402细胞、ECP总液作用L02细胞48小时后,表现为细胞数量减少不明显。 ②MTT法示,ECP总液、ECP蛋白质和5-Fu对Bel-7402细胞的抑制率分别为0.788、0.453、0.944,而ECP上清液对Bel-7402细胞的抑制率为0.198,ECP总液对L02细胞的抑制率为0.095。 ③MTT法示ECP总液在12mg/ml、1.2mg/ml、0.12mg/ml、0.012mg/ml、0.0012mg/ml时,对肝癌细胞株Bel-7402的抑制率分别为0.788、0.608、0.308、0.207、0.099,其半数抑制浓度(IC50)为9.597mg/ml。ECP蛋白质在2.9mg/ml、0.29mg/ml、0.029mg/ml、0.0029mg/ml、0.00029mg/ml时,对肝癌细胞株Bel-7402的抑制率分别为0.453、0.208、0.145、0.077、0.063, IC50为1.372mg/ml。 ④细胞生长-抑制率曲线示对Bel-7402细胞抑制率,随ECP总液和ECP蛋白质的浓度的增加而依次提高,与Bel-7402阴性对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。 ⑤MTT法示ECP总液在12mg/ml、1.2mg/ml、0.12mg/ml、0.012mg/ml、0.0012mg/ml时,对肝细胞株L02的抑制率分别为0.095、0.040、0.037、0.022、0.005。 结论： ①ECP总液中抑制肝癌细胞株Bel-7402生长的主要是ECP中的蛋白质成分,ECP总液和ECP蛋白质能抑制Bel-7402细胞的增殖,且抑制作用呈剂量依赖效应；ECP上清液对肝癌细胞株Bel-7402的增殖没有明显影响。 ②ECP总液对肝细胞株L02的增殖没有明显影响。 第二章蜈蚣蛋白质抗肿瘤活性成分的分离纯化 目的：逐层分离纯化蜈蚣总蛋白质,观察肝癌细胞株Bel-7402对所得产物的敏感性并进行有效成分鉴定。 方法：①体外培养肝癌细胞株Bel-7402,采用Bestarose Cross Link-6B (CL-6B)凝胶过滤、DEAE Sepharose FF离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤对ECP蛋白质进行分离纯化；将得到的产物分别以不同浓度干预Bel-7402细胞,采用MTT法进行体外抑瘤活性检测；②利用倒置光学显微镜,观察经不同浓度ECP蛋白质的分离物处理后Bel-7402细胞形态的变化,以找出蜈蚣主要抗肿瘤活性蛋白质；③通过SDS-PAGE电泳对有效成分进行分子量测定。 结果：①ECP蛋白质经过CL-6B凝胶过滤层析后,得到5种成分。光镜下、细胞计数和MTT法示,C、E液抑制Bel-7402细胞生长明显,其所含蛋白质分子量范围分别在1.6X106～2.2X106、1X104～4X105。MTT法和细胞生长-抑制率曲线图示,对Bel-7402细胞抑制率随C、E液的浓度的增加而依次提高。与Bel-7402阴性对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。 ②将C、E液合并通过DEAE Sepharose FF离子交换层析后,得到7种成分,光镜下、细胞计数和MTT法示G、I液抑制Bel-7402细胞生长明显,其所含蛋白质等电点在6.8以下。MTT法和细胞生长-抑制率曲线图示,对Bel-7402细胞抑制率随G、I液的浓度的增加而依次提高。与Bel-7402阴性对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。 ③将G、I液合并通过Sephadex G-75凝胶过滤层析后,得到4种成分,光镜下、细胞计数和MTT法示,O、P液抑制Bel-7402细胞生长明显,其所含蛋白质分子量范围分别在4×104～6×104、2×104～4×104。MTT法和细胞生长-抑制率曲线图示,对Bel-7402细胞抑制率随O、P液的浓度的增加而依次提高。与Bel-7402阴性对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。O液的IC50为1.132mg/ml, P液的IC50为1,129 mg/ml。 ④SDS-PAGE电泳结果示,O、P液含多种蛋白质,其中O液包括7条含量较高的蛋白质,其分子量分别在120kD (1kD=103),60 kD,48 kD,35 kD,33 kD,25 kD,20 kD左右。P液中存在6条含量较高的蛋白质,其分子量分别在120kD,80 kD,35 kD,33 kD,25 kD,20 kD左右。 ⑤光镜下、细胞计数和MTT法示不同浓度的A、B、D、H、J、K、L、M、N液对肝癌细胞株Bel-7402的生长抑制作用不明显。 结论： ①经CL-6B、DEAE FF、Sephadex G-75得到的抗肿瘤活性成分,两者均为酸性蛋白质混合物,其分子量范围在2×104-6×104之间； ②O液和P液均能抑制Bel-7402细胞的增殖,其作用呈剂量依赖性,O、P液体外抑瘤活性较ECP总液均提高了约8.5倍； 第三章ECP总液对肝癌细胞株Bel-7402的作用及机制的研究 目的：研究ECP总液对肝癌细胞株Bel-7402中Galectin-7和p-JNK1表达的影响,并进一步探讨其作用机制。 方法：以半数抑制浓度的ECP总液(1Omg/ml)诱导肝癌细胞株Bel-7402不同时间(0h、3h、6h、12h、24h、48h),通过Western blot、Real time-PCR、免疫荧光检测细胞内Galectin-7和p-JNK1的蛋白及mRNA表达；用Galectin-7-siRNA预处理Bel-7402细胞,再予lOmg/ml ECP总液诱导48 h,观察Galectin-7的蛋白及mRNA表达和p-JNK1的蛋白表达变化。 结果：①Western blot、Real time-PCR、免疫荧光均显示,ECP总液干预呈时间依赖性上调肝癌细胞株Bel-7402中Galectin-7和p-JNK1的蛋白及mRNA,与对照组相比差异有统计学意义(P0.01)。 ②Western blot、Real time-PCR、免疫荧光均显示,Galectin-7-siRNAs可显著抑制ECP总液对Galectin-7的蛋白及mRNA表达的诱导作用,与ECP总液刺激组相比差异有统计学意义(P0.05)。 ③Western blot显示,Galectin-7-siRNAs可显著抑制ECP总液对p-JNK1蛋白表达的诱导作用,与ECP总液刺激组相比差异有统计学意义(P0.05),与对照组相比差异有统计学意义(P0.05)。 结论： ECP总液呈时间依赖性上调肝癌细胞株Bel-7402中Galectin-7的蛋白及mRNA和p-JNK1的蛋白及mRNA,提示ECP总液可能通过Galectin-7-JNK途径促进肝癌细胞株Bel-7402的凋亡。