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《中南大学》 2011年
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核糖体基因区锌指酶位点靶向载体的构建及其打靶研究

肖涤  
【摘要】:核糖体基因(rDNA)区可能是一个安全有效的基因打靶区域,我室基于此开发的非病毒人源基因载体系统——核糖体基因区靶向载体,能携带多种治疗基因在多种细胞系中成功打靶rDNA 18S区+5468位点,且外源基因能长期稳定地表达。进一步提高rDNA区的打靶效率可以更充分地发挥该区域作为基因治疗靶位点的潜能,尤其在打靶病人来源的原代细胞方面带来突破。近年来,锌指酶作为提高基因打靶效率的有力工具被广泛应用,甚至能将打靶效率提高5000倍以上。我室针对rDNA内部转录间隔1(ITS1)区+6523-+6546位点设计的锌指酶ZFN-S3,体内体外实验检测均表明其具有较高的切割双链DNA的活性。ZFN-S3可能是用于提高rDNA区打靶效率有效工具。 目的:针对ZFN-S3的切割位点设计、构建核糖体基因区锌指酶位点靶向载体——pHr1-NL、pHr2-NL,证实该载体打靶rDNA区的可行性,为该载体联合锌指酶ZFN-S3高效打靶rDNA区奠定基础。 方法:载体pHr1-NL的构建:首先用PCR法克隆约2kb的rDNA同源序列。然后将无启动子但5’端有EMCV-IRES序列的新霉素磷酸转移酶(Neo)基因亚克隆至同源序列的rDNA ITS1区,利用“启动子陷阱”策略富集同源重组子。并在Neo基因两侧加入同向的loxP位点,用于后续的特异性基因删除。载体pHr2-NL的构建:将pHr1-NL上rDNA+5513-+6523的同源序列替换成rDNA+937-+6523同源序列。将构建好的载体pHr1-NL、pHr2-NL利用核转染技术转染人类纤维肉瘤(HT1080)细胞,通过筛选、挑取和计数细胞克隆、鉴定定点整合等步骤,对其rDNA区的打靶进行研究。 结果:1、构建的载体pHr1-NL经EcoR V、ClaⅠ酶切鉴定,所获得的酶切片段大小与理论值相符。2、构建的载体pHr2-NL经EcoR V、AatⅡ酶切鉴定,所获得的酶切片段大小与理论值相符。3、载体pHr1-NL、pHr2-NL的测序结果与理论序列相符。4、采用核转技术将pHr1-NL转染到HT1080细胞中,G418筛选后PCR鉴定了13个抗性克隆,并未获得定点整合克隆。5、采用核转技术将pHr2-NL转染到HT1080细胞中,G418筛选后PCR鉴定了12个抗性克隆,并获得了1个定点整合克隆。 结论:构建的含loxP位点的核糖体基因区锌指酶位点靶向载体PHr2-NL能将Neo基因定点整合至rDNA ITS1区,为联合锌指酶ZFN-S3高效打靶hrDNA区奠定了基础。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q78

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