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辣椒WRKY转录因子CaWRKY6和CaWRKY30基因的克隆、表达及功能分析

郑井元  
【摘要】:辣椒(Capsicum annuum L.)是我国最主要的蔬菜作物之一,具有重要的经济价值。但辣椒也容易受到各种病原物的危害,近年来由根结线虫(Meloidogyne spp.)侵染引起的根结线虫病已成为辣椒生产中的主要病害之一,由于高抗根结线虫品种的缺乏,生产上主要采用一些高毒、高残留的化学药剂进行防治,从而导致产品的农药残留超标、生态环境的污染和土壤质量的退化,成为蔬菜清洁生产中一个亟待解决的突出问题。 本研究主要从分子水平上来探索辣椒与南方根结线虫早期亲和与不亲和互作的机制,克隆此过程中的关键调控基因并进行功能分析,以期为辣椒的抗性育种提供新思路。 本研究以含有单显性抗根结线虫基因Me3的辣椒HDA149与南方根结线虫亲和与不亲和互作为基础,采用新一代Solexa高通量测序技术,构建了辣椒与南方根结线虫亲和与不亲和互作的转录组cDNA序列数据库。在此基础上,利用RACE方法从辣椒与根结线虫不亲和互作的辣椒根组织中分离出两个推定的WRKY转录因子,并对两个WRKY基因的分子特征和相关功能进行了研究,实验获得的主要结果如下: 1.鉴定了针对Me3基因不同毒力的南方根结线虫(M.incognita)接种辣椒后的表型差异;在此基础上,建立了辣椒与根结线虫亲和互作转录组(SR)cDNA序列数据库和不亲和互作转录组(SR)的cDNA序列数据库,总共获得了214,909条EST序列,其中HR含190,213条,SR含177,407条;筛选了SR和HR转录组中显著上调表达的EST序列,分别为3,615和1,982条,并对其进行了功能GO分类;发现了仅在SR或HR转录组中表达的特异性EST序列,分别为24,696和37,502条,其中具有生物学分析价值的序列分别为382条和187条,同时对其功能进行了GO分类;筛选了部分SR中的EST序列如生长素相关蛋白、乙烯应答转录因子等,HR中如病程相关蛋白、过氧化物酶基因等进行了实时荧光定量RT-PCR验证; 2.克隆得到了两个辣椒WRKY转录因子CaWRKY30和CaWRKY6, CaWRKY30的全长cDNA1533bp, NCBI GenBank登录号FJ360844,编码区全长1095bp,编码推定的364个氨基酸,分子量大小为41.2kD,等电点6.57; CaWRKY6的全长CDNA1944bp,编码区全长1662bp, NCBI GenBank登录号GQ253367,编码推定的553个氨基酸,分子量大小60.18kD,等电点6.96; 3.克隆得到了CaWRKY30和CaWRKY6基因编码区的基因组DNA序列,CaWRKY30基因编码区DNA全长1743bp,含有3个外显子和2个内含子;CaWRKY6基因编码区DNA全长2530bp,含有6个外显子和5个内含子;Southern杂交证实CaWRKY30和CaWRKY6基因在基因组中都以单拷贝的形式存在,是单拷贝基因; 4. CaWRKY30基因受水杨酸(SA),辣椒疫霉菌、烟草花叶病毒、辣椒青枯菌、非毒性南方根结线虫的诱导而上调表达,但表达受到茉莉酸甲酯(MeJA)的抑制;CaWRKY6基因受辣椒疫霉菌、烟草花叶病毒、辣椒青枯菌、非毒性南方根结线虫的诱导而上调表达,但受茉莉酸甲酯(MeJA)的抑制;建立并优化了CaWRKY6与CaWRKY30基因的原核表达系统; 5.基因的亚细胞定位分析表明CaWRKY30和CaWRKY6蛋白都定位于细胞核,是在细胞核中起转录调控作用的转录因子; 6.构建了含有WRKY基因特异性片段的TRV表达载体,病毒侵染辣椒后RT-PCR验证WRKY基因的沉默效应。CaWRKY30基因沉默的辣椒H1)A149植株接种非毒性南方根结线虫后,辣椒植株的抗性没有改变,根结和卵块数量与对照相比差异不显著,推测这可能与WRKY基因的功能互补、或者沉默不彻底而只需少量转录本就可正常发挥功能的特性有关;CaWRKY6基因沉默的辣椒植株则在根结线虫侵染后,根结和卵块显著增加,CaWRKY6基因的沉默降低了辣椒对根结线虫的抗性。 7.构建了CaWRKY30和CaWRKY6基因分别与pCAMBIA2300融合的植物表达载体,通过农杆菌介导的转化方法分别导入到了番茄MoneyMaker和烟草植株(Nicotiana tabacum L)中,并分别获得了CaWRKY30和CaWRKY6基因的转基因T0代植株;转基因超表达CaWRKY30的番茄和超表达CaWRKY6基因的烟草对表型没有任何影响;转基因超表达CaWRKY30基因的番茄植株对南方根结线虫入侵的敏感性增大,植株的抗性降低,CaWRKY30基因在介导植物的根结线虫应答反应中起负调控作用。 辣椒与根结线虫互作转录组cDNA数据库的构建为深入分析这一互作机制,挖掘抗性相关基因提供了丰富的cDNA资源;同时抗性相关WRKY基因的克隆与功能分析为将来利用WRKY基因的转录调控来创新辣椒的抗线虫育种提供了新的证据,更为利用WRKY基因的来构建高效的抗线虫分子育种途径奠定了基础。


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