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《中南大学》 2012年
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高通量深度测序绘制系统性红斑狼疮CD4~+T细胞全基因组MicroRNAs表达谱

程文静  
【摘要】:系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种涉及多个器官和系统的慢性自身免疫性疾病,以产生多种自身抗体为特征,其临床表现具有多样性,包括面部蝶形红斑、光敏感、关节炎和肾损害等。近几十年来,由于诊断和治疗水平的提高,大部分SLE患者的5年生存率均可以超过90%,但是长期的随访研究显示SLE导致器官受损的情况下,尤其是在肾功能衰竭和心血管疾病的案例中,患者的生存状况仍不容乐观。SLE的发病机制和具体病因迄今不明,遗传和性激素可能与SLE发病有关,但仅用遗传和性激素因素不能完全解释SLE的发病机制。近年来的研究结果表明异常的表观遗传调控包括DNA甲基化、组蛋白修饰、microRNAs (miRNAs)在SLE的发生、发展中起重要作用,而CD4+T细胞过度活化也是SLE发病机制的特点之一。本课题组先前的研究发现miR-126对于SLECD4+T细胞甲基化具有调控作用,推测其余众多的miRNAs也可能与miR-126类似,参与SLE发生和发展。 miRNA在1993年即被发现,但是2005年之后才逐步成为表观遗传学范畴的研究热点。它们是一类长度约19-25核苷酸(nt)的内源性单链非编码小RNA分子。现已有多项研究证实miRNAs参与人体生长发育等多种生物学进程,部分1niRNAs异常表达可诱导自身免疫反应。 近年来,miRNAs表达检测技术飞速发展,其中miRNA高通量深度测序获得了广泛关注,研究者们将此项技术与其他多种实验方法联合使用使越来越多的miRNA功能得到证实。与局限性较大的第一代Sanger测序相比,第二代测序技术具有高通量、高质量、省时省力和操作平台简易等优势,是鉴定样品中已知和未知miRNA,并进行差异性分析的重要工具。目前第二代大规模测序技术主要包括454焦磷酸测序、Solexa合成测序和SOLiD连接测序3种,其应用均在DNA和RNA水平的多项研究中占据优势。 因此,本实验通过利用Solexa测序来筛选正常人和不同临床表型的SLE患者CD4+T细胞中差异表达miRNAs,并采用Real-time qPCR扩大样本量验证测序结果,初步绘制不同表型的SLE患者CD4+T细胞1miRNAs表达谱,为深入探讨SLE患者器官受累的分子机制奠定实验基础。 第一部分SLE CD4+T细胞microRNAs高通量深度测序 目的筛选正常人和不同器官受累的SLE CD4+T细胞中差异表达的miRNAs。 方法 1.收集4例正常人和12例SLE患者(皮肤型4例,皮肤和肾脏受累型4例,皮肤、肾脏及关节受累型4例)外周血,密度梯度离心分离单个核细胞,进一步利用CD4磁珠分离CD4+T细胞; 2. Trizol法提取各样本总RNA,每组4例样本均匀混合成一个pool,共产生4个测序样本pool,正常对照标记为NC,另3个根据SLE患者器官受累不同,分别标记为S(皮肤)、SK(皮肤+肾脏)和SKJ(皮肤+关节+肾脏); 3. Solexa测序检测来自正常人和SLE患者CD4+T细胞中多种miRNAs表达水平并进行差异分析。 结果每个样本测序约产生1,000,000reads,长度区间在21-23nt的miRNAs约占所有小RNA总量的60%。通过4组样本两两比较分析,我们发现与正常对照相比,有38个miRNAs在S组、SK组和SKJ组中表达均显著上调,2个miRNAs表达均下调(log2-ratio1或-1;P0.01)。测序结果显示:①与正常对照组相比,SLE患者组的miR-126和miR-181b表达水平均显著上调,相反miR-142-3p和miR-505在患者组均显著下调,差异均有显著统计学意义(P0.01);miR-451在S组和SK组显著上调(P0.01),在SKJ组上调但无统计学意义(P=0.0857)。②不同临床表型SLE患者组内两两比较显示:miR-126和miR-181b的表达水平按照SSKJSK的梯度显著升高(P0.01或0.05);miR-451在S组的表达量显著高于SK组和SKJ组且具有统计学意义(P0.01),但在SK组和SKJ组两组之间miR-451表达水平无统计学差异(P=0.0528);miR-142-3p的表达水平按照SSKSKJ的梯度变化,且具有统计学意义(P0.01);miR-505的表达水平无显著改变(P0.05)。 结论 1.通过高通量测序,我们筛选到大量miRNAs在SLE患者CD4+T细胞中表达异常,如miR-126、miR-181b、miR-451、miR-142-3p、miR-505等,这些miRNAs可能与SLE的发生、发展相关。 2.通过不同临床表型组的两两比较分析,初步推测miR-126和miR-142-3p等可能与SLE患者多器官受累相关。 第二部分部分microRNA测序结果的验证 目的扩大样本数量,利用RT-qPCR验证不同临床表型SLE患者和正常对照CD4+T细胞中miR-126、miR-181b、miR-451、miR-142-3p、miR-505表达水平。 方法收集10例正常人及30例SLE患者(S、SK、SKJ组各10例)外周血CD4+T细胞,采用第一节相同的方法获得每个人的总RNA,利用商品化引物通过RT-qPCR检测正常人和SLE患者miR-126、miR-181b、miR-451、miR-142-3p、miR-505表达水平。 结果与正常对照组相比,SLE患者CD4+T细胞中miR-126、miR-181b、miR-451在3个患者组均显著上调,miR-142-3p、miR-505均显著下调(P0.05),与测序结果一致。进一步,两两比较不同临床表型SLE患者CD4+T细胞中miRNAs表达差异。结果显示:miR-126在SKJ组的表达水平显著高于S组和SK组(P0.05),而其表达水平在S组和SK组的中无显著性差异(P0.05)。miR-181b在S组的表达高于SK组和SKJ组且有统计学意义(P0.05),但是其表达在SK组和SKJ组的比较中无统计学意义(P0.05)。miR-451的表达差异在各患者组之间的两两比较中均有统计学意义(P0.01或0.05)且表达量按照SKJSKS的梯度升高。miR-142-3p表达水平在SKJ组较S组和SK组显著降低(P0.01)。在各患者组之间的两两比较中,miR-505的表达差异均无统计学意义(P0.05)。 结论 1. Real-time qPCR的验证和高通量测序结果基本一致,提示miR-126、miR-181b、miR-451、miR-142-3p、miR-505异常可能参与SLE发病。 2.通过Real-time qPCR扩大样本验证,初步发现miR-126与miR-451表达水平显著升高及miR-142-3p表达水平显著降低可能与SLE患者多器官受累密切相关。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R593.241

【参考文献】
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