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《中南大学》 2012年
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脂肪酸结合蛋白在棕榈酸诱导巨噬细胞凋亡中的作用及机制

李卉  
【摘要】:目的:探讨脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(A-FABP)在棕榈酸诱导巨噬细胞凋亡中的作用。 方法:体外培养人单核细胞白血病细胞系(Thp-1细胞),加入佛波酯(PMA)培养72小时使其分化为巨噬细胞后,用不同浓度棕榈酸(50μM,100μM,200μM,500μM)处理,在不同时间点提取细胞mRNA和蛋白,用Real-Time PCR以及Western blot检测A-FABP蛋白的表达。采用ELISA以及Western blot检测Thp-1源巨噬细胞凋亡。同时用A-FABP siRNA转染Thp-1源巨噬细胞,观察A-FABP基因沉默对棕榈酸诱导的上述指标变化的影响。 结果:在棕榈酸作用下,Thp-1源巨噬细胞中A-FABP mRNA水平和蛋白水平随棕榈酸浓度增加而上升;此外,随着棕榈酸处理时间的延长,A-FABP mRNA水平和蛋白水平也随棕榈酸干预时间延长而上升。ELISA细胞凋亡检测结果显示,棕榈酸呈时间依赖和浓度依赖方式诱导DNA链断裂损伤加重;A-FABP siRNA可显著减少棕榈酸诱导的DNA链断裂损伤。凋亡相关蛋白检测结果显示,棕榈酸组的Bax蛋白表达明显高于对照组,Bcl-2蛋白表达明显低于对照组。A-FABP siRNA组予棕榈酸培养24h,其Bax蛋白表达较棕榈酸组明显减少,Bcl-2蛋白表达明显增加。 结论:棕榈酸可诱导巨噬细胞凋亡,该作用通过A-FABP介导。 目的:①探讨棕榈酸对巨噬细胞线粒体功能和线粒体凋亡途径的影响;②探讨A-FABP在棕榈酸诱导巨噬细胞线粒体功能障碍和线粒体凋亡途径激活中的作用。 方法:采用荧光染色检测细胞内活性氧(ROS)含量;JC-1染色法检测线粒体膜电位;ATP检测试剂盒检测细胞ATP含量;总丙二醛(MDA)检测试剂盒检测细胞总MDA含量;caspase3活性检测试剂盒检测caspase3活性;caspase9活性检测试剂盒检测caspase9活性;梯度离心法抽提线粒体;线粒体琥珀酸脱氢酶(SDH)检测试剂盒检测细胞线粒体琥珀酸脱氢酶活性;线粒体呼吸链复合物Ⅳ检测试剂盒检测线粒体呼吸链复合物Ⅳ活性;Western blot检测细胞色素c表达。 结果:在棕榈酸作用下,Thp-1源巨噬细胞内ROS水平增加,线粒体膜电位下降,促进线粒体细胞色素c释放至胞浆,caspase3和caspase9活性增强,线粒体凋亡途径被激活;棕榈酸还引起Thp-1源巨噬细胞呼吸链活性受抑、ATP生成减少、细胞脂质过氧化加重,线粒体功能受损。而A-FABP siRNA转染组予棕榈酸培养24h后,与棕榈酸组比较,ROS水平明显减低,线粒体膜电位恢复,细胞色素c释放减少,caspase3和caspase9舌性下降,呼吸链复合物Ⅳ活性增加,ATP水平升高,脂质过氧化减轻。 结论:棕榈酸诱导巨噬细胞的线粒体呼吸链活性受抑,ATP生成减少,ROS生成增加,引起线粒体功能障碍并激活线粒体凋亡途径。A-FABP基因沉默可部分逆转这一过程。 目的:①探讨棕榈酸对巨噬细胞线粒体生物合成与抗氧化能力的影响;②探讨A-FABP在棕榈酸诱导线粒体生物合成与抗氧化能力变化中的作用。 方法:Real-Time PCR方法检测线粒体DNA拷贝数;Western blot和Real-Time PCR检测抗氧化酶和线粒体生物合成相关的蛋白和基因表达。Mito-Tracker Green荧光探针法标记细胞线粒体,检测线粒体数量。 结果:Thp-1源巨噬细胞经棕榈酸处理后,棕榈酸诱导抗氧化酶包括锰超氧化物歧化酶(MnSOD)、铜锌超氧化物岐化酶(Cu/ZnSOD)、解偶联蛋白2(UCP2)的mRNA水平下降,同时生物合成相关蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC-1α)、线粒体核呼吸因子(NRF-1)和雌激素相关受体α(ESRRA) mRNA水平和PGC-1α蛋白表达下调,荧光探针法检测棕榈酸组的线粒体数量减少,而线粒体转录因子A (TFAM)和线粒体DNA拷贝数无明显变化。A-FABP siRNA转染组予棕榈酸培养24h后,与棕榈酸组比较,MnSOD、Cu/ZnSOD和UCP2的mRNA水平增加,PGC-1α、NRF-1和ESRRA表达上调,荧光探针法检测的线粒体数量增加,而TFAM和线粒体DNA拷贝数无明显变化。 结论:A-FABP介导棕榈酸引起的线粒体生物合成减少及抗氧化能力受损,从而调控细胞内氧化应激和线粒体功能。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R363

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【引证文献】
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