重组腺相关病毒对造血干细胞高效转导的优化
【摘要】：目的：重组腺相关病毒(rAAV)被认为是最具应用前景的基因治疗病毒载体,应用其进行β-地中海贫血治疗是一项具有极大的应用价值的研究。然而rAAV感染效率低下一直是困扰研究者的难题,特别是对本身就难以感染的造血干细胞来说,其感染效率更加不理想。本研究从rAAV的包装到感染各过程进行研究探索,对比优化其包装及感染过程中的材料方法,并进行改进。致力于获得高效感染造血干细胞的AAV病毒及感染条件。
方法与结果：本研究主要集中于病毒包装过程和感染过程的优化与改进。在病毒的包装中,本实验分别采用PEI转染法及磷酸钙转染法包装病毒；超速离心层析纯化法及肝素-琼脂糖亲和纯化法纯化rAAV病毒,qPCR法及斑点杂交法进行病毒滴度测定,对比各种方法对rAAV感染活性的影响及区别,对rAAV病毒包装过程造成rAAV活性降低的步骤予以优化及改进,获得了一套完整的优化的包装高活性高感染效率的rAAV包装体系。在感染过程中的优化阶段,引入了自身互补腺相关病毒(scrAAV),同时结合采用rAAV外壳突变技术,对rAAV衣壳蛋白上暴露的酪氨酸位点进行突变,获得外壳突变型rAAV,很大的提高了rAAV对造血干细胞的感染效率。与此同时,在感染的过程中,发现感染体系中的各个感染条件对于rAAV的感染效率有十分大的影响。于是对感染条件：感染时间、血清浓度、感染滴度及感染后处理等进行了详细的探索,发现他们之间存在着复杂的相互影响,经过一系列实验,优化得到一个针对于造血干细胞的感染体系,相对以前的感染体系,大幅提高了感染效率。同时对感染前处理进行了探索,并首次发现ZY可以提高rAAV的感染效率,特别是结合羟基脲,可以很大幅度增加rAAV的感染效率,这是首次发现。
结论：通过对一系列的指标的优化和改进,获得了一套完整的优化的包装高活性高感染效率的rAAV包装体系。同时得到了针对造血干细胞的高效感染体系。于世界首次发现了ZY对rAAV感染效率的提高作用。
【关键词】：腺相关病毒 造血干细胞 基因治疗 感染效率 【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R329
【目录】：
- 摘要4-6
- ABSTRACT6-8
- 目录8-10
- 英文缩略词表10-11
- 前言11-14
- 第一章 重组腺相关病毒的包装与纯化的优化14-27
- 1.1 材料与方法14-19
- 1.1.1 材料14-17
- 1.1.2 方法17-19
- 1.1.3 统计学分析19
- 1.2 实验结果19-25
- 1.2.1 质粒提取与鉴定19-20
- 1.2.2 包装方法的比较与优化20-21
- 1.2.3 纯化方法的比较21-22
- 1.2.4 qPCR测定AAV病毒滴度法的建立与优化22-25
- 1.3 本章小结25-26
- 1.4 讨论26-27
- 第二章 重组腺相关病毒对造血干细胞感染的优化27-47
- 2.1 材料与方法27-30
- 2.1.1 材料27-28
- 2.1.2 方法28-30
- 2.2 实验结果30-44
- 2.2.1 ：双链rAAV2感染效率优于单链rAAV230
- 2.2.2 ：rAAV感染条件对感染效率的影响30-34
- 2.2.3 ：HSC的最佳感染条件探索34-36
- 2.2.4 ：羟基脲对rAAV感染的影响36-40
- 2.2.5 ：ZY对rAAV感染的影响40-43
- 2.2.6 ：HU联合ZY对rAAV感染HSC的作用43-44
- 2.2.7 ：Y730+444+500F外壳突变型rAAV感染效率最高44
- 2.3 本章小结44-45
- 2.4 讨论45-47
- 结论47-48
- 综述48-52
- 参考文献52-56
- 致谢56-57
- 攻读学位期间主要的研究成果57
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