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《中南大学》 2013年
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携带HLA-G慢病毒转染大鼠原代培养肝细胞及对抗大鼠肝移植排斥反应的研究

孙培龙  
【摘要】:目的:人类白细胞抗原G(HLA-G)因为在母体胎儿之间的免疫耐受中发挥了关键性作用而被注意,提示它可能应用于器官移植。HLA-G在体外诱导表达已被证实有诱导免疫耐受的特性,移植术后患者体内HLA-G的表达已被证实与移植术后急性和慢性排斥反应发生率降低有关。我们使用转染携带人HLA-G基因的慢病毒转染大鼠原代培养肝细胞及大鼠移植肝脏,在体外及在体条件下探讨HLA-G的表达是否有直接保护移植肝脏免受排斥反应损伤的效果。 方法:1、取260只健康雄性SD大鼠,分三个阶段进行,先建立大鼠原位肝移植模型的手术训练和探索。手术熟练后,取40只SD大鼠和40只Wistar大鼠,建立SD至Wistar大鼠肝移植急性移植排斥反应模型。2、建立携带HLA-G的慢病毒表达体系。3、进行SD大鼠肝细胞原代培养。4、将携带人HLA-G的慢病毒转染SD大鼠原代培养肝细胞,转染后7天,通过免疫荧光、RT-PCR和Western Blot实验进行检测,分别从病毒转染、mRNA水平和蛋白水平全面评价HLA-G慢病毒转染的效果。5、采用kamada二套管法建立SD和Wistar大鼠的原位肝移植模型45例,随机分为三组,每组15例。实验组在SD大鼠的供体肝脏取下后,从门静脉输注2ml包含有107TU/ml携带HLA-G基因的慢病毒,将携带人HLA-G的慢病毒转染大鼠供肝,与不加任何处理的对照组和术后规律使用FK506的对照组进行对比,对比术后三组肝组织中的HLA-G的表达水平、术后第7天、第14天和第56天的AST和BIL值以及病理切片、术后生存天数。探讨携带HLA-G基因的慢病毒转染供肝,是否可对抗大鼠急性肝移植排斥反应。 结果:1、经训练,成功建立SD至Wistar大鼠肝移植急性移植排斥反应模型。2、携带人HLA-G的慢病毒可成功转染SD大鼠原代培养肝细胞。3、转染携带有HLA-G'慢病毒的实验组术后7天大鼠的AST和BIL值,与术后使用FK506的对照组差别有显著性(P0.05),与术后不加处理的对照组差别有极显著性(P0.01)。转染携带有HLA-G慢病毒的实验组术后12天、56天大鼠的AST和BIL值,与术后使用FK506的对照组差别有显著性(P0.01);转染携带有HLA-G的实验组的AST和BIL值,与术后不加处理的对照组差别有极显著性(P0.01)。对照组中位生存时间12.00天,FK506组中位生存时间70.50天,HLA-G组中位生存时间91.50天,各组之间差别有显著性(P0.01)。提示这种治疗可延长受体大鼠的存活期。病理切片结果显示,转染携带有HLA-G慢病毒的实验组和术后使用FK506的阳性对照组,术后7天病理切片仅有轻度排斥反应,而术后不加任何处理的阴性对照组则显示为重度排斥反应。术后56天,FK506组病理切片显示存在轻度排斥反应,而HLA-G组无排斥反应。 结论:1、转染携带有HLA-G慢病毒作为治疗性的手段用于大鼠肝移植急性排斥反应模型,能有效保护大鼠移植肝的功能和延长存活期。2、体外实验及动物实验均表明,肝细胞对慢病毒介导的基因转移易感,表明慢病毒对肝细胞有很高的转导效率,且转入的外源基因可长期表达。图16幅,表9个,参考文献316篇
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R657.3

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