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《中南大学》 2013年
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氧糖剥夺再灌注后高尔基体的形态变化及其可能机制的探讨

莫晓叶  
【摘要】:第一章氧糖剥脱再灌注后高尔基体的形态变化 目的:探讨氧糖剥脱再灌注后高尔基体的形态变化以及其结构蛋白GM130的表达。 方法:以小鼠神经瘤母细胞株N2a细胞为研究对象,经历氧糖剥夺再灌注过程后,采用CCK-8法检测细胞活力,TUNEL荧光染色法评估细胞凋亡,并应用免疫细胞化学方法观察高尔基体的形态变化,应用Western blot技术检测GM130和磷酸化GM130(phospho-GM130)的蛋白表达。 结果: 1. CCK-8法显示,氧糖剥夺后再灌注6小时、12小时、24小时和48小时,细胞活力均明显降低,与正常组之间比较,具有显著性统计学差异(P0.05); 2. TUNEL荧光染色结果显示,与正常组相比,氧糖剥夺4小时和再灌注6小时的凋亡细胞比率较少(P0.05),而再灌注12小时、24小时和48小时的凋亡细胞比率逐渐增高(P0.05),再灌注48小时组凋亡细胞比率最高(P0.05); 3.免疫细胞化学结果显示,再灌注24小时,高尔基体出现肿大,失去原有形态,结构松散,少量囊膜断裂,而再灌注48小时后,高尔基体的正常形态被破坏,出现明显碎裂,呈碎片状或颗粒状,散在于细胞内; 4. Western blot结果显示,与正常组比较,氧糖剥夺4小时以及再灌注6小时、12小时、24小时的总GM130蛋白表达水平无明显改变(P0.05),再灌注48小时,细胞内总GM130的蛋白表达出现下降,差异具有统计学意义(P0.05);而正常组、氧糖剥夺4小时组以及再灌注6小时组细胞内phospho-GM130基本不表达,再灌注12小时组有少量表达(P0.05),再灌注24小时和48小时,细胞内phospho-GM130的表达明显增多,与正常组相比,差异具有统计学意义(P0.05)。 结论: 1.氧糖剥夺再灌注损伤引起高尔基体碎裂; 2.氧糖剥夺再灌注后,磷酸化GM130蛋白的表达增加,可能与高尔基体的形态损害有关。 第二章Cdkl抑制剂对氧糖剥夺再灌注后高尔基体形态的影响 目的:Cdkl抑制剂抑制GM130的磷酸化,探讨氧糖剥夺再灌注后GM130磷酸化对高尔基体形态的影响。 方法:以N2a为对象,经历氧糖剥夺再灌注后,应用Western blot和Real time PCR技术检测各时间点Cdk1的蛋白和mRNA变化;Cdk1抑制剂Purvalanol A干预细胞后,经氧糖剥夺再灌注,CCK-8法检测细胞活力,免疫细胞化学技术观察高尔基体的形态改变,免疫荧光共聚焦研究GM130和phospho-GM130在细胞内的定位和表达,Westernblot技术检测Purvalanol A干预后各组Cdkl. GM130和phospho-GM130的蛋白表达。 结果: 1.经历氧糖剥夺再灌注后,Western blot结果提示,再灌注12小时、24小时、48小时后,Cdkl的蛋白表达明显增高(P0.05);Real time PCR结果发现,Cdk1mRNA在氧糖剥夺4小时、再灌注6小时出现明显下降(P0.05),而在再灌注12小时、24小时和48小时出现显著上升(P0.05); 2. CCK-8法结果显示,应用Purvalanol A干预后,再灌注24小时和48小时,N2a细胞的活力出现降低(P0.05); 3.免疫细胞化学结果显示,Purvalanol A干预后,氧糖剥夺4小时以及再灌注6小时、12小时、24小时,高尔基体形态基本维持正常,直到再灌注48小时,可见部分细胞内高尔基体肿胀,结构松散,并有少量碎裂片段; 4.免疫荧光共聚焦结果显示,phospho-GM130和GM130在细胞内的定位和分布高度重合;未予Purvalanol A干预时,N2a细胞经氧糖剥夺再灌注后,再灌注12小时、24小时和48小时组细胞内phospho-GM130表达明显增多;而Purvalanol A干预后,各组细胞内phospho-GM130的表达明显减少; 5. Western blot结果显示,Purvalanol A干预后,N2a细胞经历氧糖剥夺再灌注后,Cdk1在各组的表达均受到了明显抑制,同样phospho-GM130在各组的表达亦均很少(P0.05)。 结论: 1.氧糖剥夺再灌注后期Cdk1表达增多,抑制Cdk1可以减少GM130的磷酸化; 2. Cdk1抑制剂可以减轻氧糖剥夺再灌注后高尔基体的形态损害,其机制可能与下调GM130磷酸化水平有关。 第三章靶向抑制Cdk1基因对氧糖剥夺再灌注后高尔基体形态的影响 目的:构建靶向抑制Cdk1基因的shRNA,进一步探讨Cdk1对氧糖剥夺再灌注后高尔基体形态的影响。 方法:设计3条靶向抑制Cdk1基因的shRNA,构建重组质粒,利用脂质体转染进入N2a细胞内,应用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,Western Blot和Real time PCR检测转染后Cdk1的蛋白表达和mRNA含量,筛选能获得最大抑制效率的shRNA表达质粒。在此基础上,细胞分为转染阳性重组质粒Cdk1-shRNA-1的实验组、转染阴性质粒Cdk1-shRNA NC的阴性对照组和未转染的空白对照组。各组经历氧糖剥夺再灌注后,应用免疫细胞化学技术观察高尔基体的形态变化,Western blot检测各组Cdk1、GM130和phospho-GM130的蛋白表达。 结果: 1.设计干扰Cdk1基因靶点的shRNA序列,并成功连接到hU6-GFP-SV40-Neomycin表达载体中,经酶切和测序鉴定插入位置正确; 2.重组质粒转染后Cdk1mRNA的变化:重组质粒组细胞(Cdk1-shRNA-1、Cdk1-shRNA-2、Cdk1-shRNA-3)的Cdk1mRNA抑制率分别为92.0±12.3%、76.3±10.2%、43.2±2.6%,其中,Cdk1-shRNA-1组的Cdk1mRNA含量最低; 3.重组质粒转染后Cdk1蛋白的变化:与空白对照组相比,重组质粒组细胞(Cdk1-shRNA-1、Cdk1-shRNA-2、Cdk1-shRNA-3)的Cdk1蛋白的表达量抑制率分别为73.1±3.3%、33.7±8.6%和4.3±8.3%,其中,Cdk1-shRNA-1组的Cdk1蛋白表达抑制最明显; 4.转染阳性质粒Cdk1-shRNA-1的实验组细胞在氧糖剥夺再灌注后,高尔基体形态基本正常,仅在再灌注48小时观察到少量细胞内高尔基体出现肿胀和轻度碎裂; 5.转染阳性质粒Cdk1-shRNA-1的实验组细胞在氧糖剥夺再灌注后GM130磷酸化水平较低,与阴性对照组和空白对照组相比,均具有明显统计学差异(P0.05)。 结论: 1.成功构建靶向抑制Cdk1基因的shRNA质粒; 2.靶向抑制Cdk1基因可以减轻氧糖剥夺再灌注损伤所致高尔基体的形态损害,与其下调GM130磷酸化水平有关。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R743.33

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【参考文献】
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