阿霉素诱导耐药肝癌细胞株miRNAs表达谱检测及miR-1246作用研究

【摘要】：第一章人肝癌耐药细胞株SMMC-7721/ADM的建立及其与人肝癌细胞株SMMC-7721及人正常肝细胞株LO2的miRNAs表达谱分析 目的 探讨人肝癌耐药细胞株SMMC-7721/ADM与其亲本细胞SMMC-7721及人正常肝细胞株LO2的miRNAs的差异表达 方法 (1)MTT法测定阿霉素对SMMC-7721的IC50,以其为起始浓度及采用顺浓度梯度法培养SMMC-7721,建立耐药细胞株SMMC-7721/ADM,绘制两细胞株的生长曲线及计算倍增时间,MTT法测ADM对SMMC-7721/ADM的IC50及计算耐药指数,western blotting测定LO2,SMMC-7721及SMMC-7721/ADM的MDR1蛋白表达。 (2) miRNA芯片分析人肝癌细胞株SMMC-7721与SMMC-7721/ADM及人正常肝细胞株LO2中差异表达的miRNAs,并采用RT-PCR验证芯片结果。 结果 (1)ADM对SMMC-7721的IC50为0.12±0.01μg/ml,两细胞株有相似的生长曲线,倍增时间无明显差异(p0.05),ADM对SMMC-7721/ADM的IC50为2.96±0.12μg/ml。耐药指数为24.67。MDR1蛋白在SMMC-7721/ADM中表达高于其亲本细胞SMMC-7721及L02(p0.05), SMMC-7721高于正常肝细胞株L02(p0.05)。 (2)通过芯片筛选,L02与SMMC-7721相比,上调2倍以上的1miRNAs有189个,下调2倍以上的有246个。SMMC-7721与SMMC-7721/ADM上调2倍以上的有176个,下调2倍以上的有159个。SMMC-7721/ADM与L02相比上调2倍的有160个,下调2倍的有134个。在LO2, SMMC-7721, SMMC-7721/ADM中表达差异两倍以上且依次上调的有miR-1246, miR-3676-5p, miR-4443,依次下调的有miR-101-3p, miR-1469。RT-PCR验证了miR-1246与miR-1469在LO2, SMMC-7721, SMMC-7721/ADM中的表达量,其结果与芯片相一致(p0.05)。 结论 (1)我们成功构建了SMMC-7721/ADM。 (2)通过对LO2, SMMC-7721,及SMMC-7721/ADM的miRNA芯片分析筛选出依次显著上调的miR-1246, miR-3676-5p和miR-4443；和依次显著下调的有miR-101-3p, miR-1469。并对miR-1246与miR-1469进行验证,证明了芯片结果的可靠性。 第二章miR-1246在肝癌耐药细胞株SMMC-7721/ADM的研究 目的 探讨miR-1246在人肝癌耐药细胞株SMMC-7721/ADM中的作用研究 方法 (1)设计及合成miR-1246inhibitor片段,转染至SMMC-7721/ADM,RT-PCR测定SMMC-7721,SMMC-7721/ADM空白转染组及SMMC-7721/ADM目的转染组及中miR-1246的表达量。。 (2)实验分组：A组为SMMC-7721,B组为SMMC-7721/ADM空白转染组,C组为SMMC-7721/ADM目的转染组。 (3)MTT检测三组细胞株的增殖能力,并测定ADM对SMMC-7721/ADM目的转染组的IC50。 (4)FCM检测三组细胞株的细胞周期。(5) FCM AV-PI检测三组细胞株的细胞凋亡。 (6) Transwell检测三组细胞株的迁移能力。(7)铺matrigel的Transwell检测三组细胞株的侵袭能力。 结果 (1)显微荧光镜下观察转染效率达到85%左右,目的转染组miR-1246含量低于空白转染组(p0.05),与SMMC-7721无明显差异(p0.05)。 (2)MTT实验结果显示C组的增殖能力较A、B组下降(p0.05),B组与A组无明显差异(p0.05)。 ADM对C组的IC50为0.08±0.01μg/ml。与SMMC-7721/ADM的IC50(2.96±0.12μg/ml)相比显著下降(p0.01),与SMMC-7721(0.12±0.01μg/ml)相比无明显差异(p0.05)。 (3)细胞周期实验示三组细胞株各周期之比无明显差异(P0.05) (4)细胞凋亡实验示C组与A、B组相比其凋亡率升高且有统计学意义(p0.05),B组与A组无明显统计学意义(P0.05)。 (5)迁移能力实验结果显示C组的迁移能力低于B组(p0.05),与A组则无明显统计学意义(p0.05),B组迁移能力高于A组(p0.05)。 (6)侵袭实验结果显示C组的侵袭能力低于B组,与A组无明显统计学意义(p0.05),B组侵袭能力高于A组(p0.05)。 结论 (1)在SMMC-7721/ADM中,通过与亲本细胞SMMC-7721分析,细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡无明显差异,而迁移侵袭能力明显增强。提示miR-1246的上调可能参与SMMC-7721/ADM的侵袭迁移能力的提高。 (2)通过对转染miR-1246inhibitor的SMMC-7721/ADM分析,细胞增殖能力降低,凋亡数增加。提示miR-1246的上调可增加耐药肝癌细胞株的增殖能力,抑制凋亡,但对细胞周期无明显影响；细胞侵袭和迁移实验的降低表明miR-1246的上调可提高耐药肝癌细胞株的迁移与侵袭能力,转染miR-1246inhibitor的SMMC-7721/ADM的48h IC50明显下降,提示miR-1246的下调使ADM对SMMC-7721/ADM敏感性增加 第三章hsa-miR-1246的生物信息学分析及靶基因预测验证 目的 对has-miR-1246进行生物信息学分析及靶基因预测和在耐药肝癌细胞株中的靶基因验证。 方法 (1)通过TargetScan、miRanDa和miRDB三个靶基因预测网站,对其进行靶基因初步筛选,选择3个网站数据库的交集基因行下一步预测研究。用DAVID数据库对miR-1246的靶基因集合行GO注释和KEGG的生物通路富集分析。 (2)确立在肝癌耐药细胞株中的靶基因,并采用western-blotting及RT-PCR验证。 结果 (1) hsa-miR-1246在TargetScan、miRanDa、miRDB数据库预测靶基因,其结果为TargetScan为178个,miRanDa为5983个,miRDB为398个,总共交集预测靶基因为57个。其中GSK3β,UNC5,SEMA6a参与KEGG通路为AXON GUIDANCE通路(Rho GTPase1家族通路)。 (2) GSK3β蛋白和mRNA表达在SMMC-7721/ADM目的转染组均高于SMMC-7721/ADM空白转染组(p0.05),与SMMC-7721组无明显差异(p0.05)。 结论 (1)对miR-1246进行了靶基因预测。结果有57个候选靶基因。 (2)通过对GSK3β验证,提示miR-1246上调引起肝癌细胞株耐药的其中一个靶基因为GSK3β。图24幅,表21个,参考文献98篇。