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《中南大学》 2014年
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MRP8和IL-1β与内侧颞叶癫痫的关系和分子机制研究

甘娜  
【摘要】:研究背景与目的: 癫痫是目前世界第三大慢性脑性疾病,亦是小儿神经系统常见疾病之一。内侧颞叶癫痫(mesial temporal lobe epilepsy, MTLE)是其重要的亚型,是目前公认的难治性癫痫之一,以海马硬化为其突出的临床病理特征。目前对于药物难治性MTLE的治疗主要是手术切除硬化的病变海马,进而控制癫痫发作,减少惊厥给大脑造成的损害,但是一部分接受海马切除的患者,仍然有惊厥的反复发作,这提示,海马硬化并不是引起患者抽搐最根本的原因,癫痫的慢性自发发作还有更为根本的原因未被人类所认识。正因为缺乏对MTLE发病机制的了解,目前MTLE主要的治疗方法还是在手术切除硬化海马的基础上,使用促细胞膜稳定的抗癫痫药物,通过减少神经元异常放电,而控制惊厥发作,但针对癫痫病因及发病机制的治疗甚少。 儿童时期的癫痫以及癫痫综合征与成年期有很大不同。在不成熟大脑中,由于大脑及突触的快速发育,使得癫痫发生的敏感性达到峰值。虽然癫痫可以在任何年龄发生,但最初的致痫损伤多发生于生后不久以及幼年时期,因为此时神经系统发育不成熟,易受异常代谢、创伤、基因突变等有害因素影响,为癫痫慢性形成埋下种子。而这些有害因素影响机体时,机体神经系统所处的成熟阶段,也是决定癫痫发作阈值和发作类型的关键因素。近二十年的研究发现,免疫系统激活、过度的炎症反应在癫痫慢性自发发作过程中起着持续而重要的作用,而在发育中的大脑,与神经系统相关的炎症反应能增加癫痫发作频率以及大脑对癫痫的敏感程度,增加癫痫的易感性。因此,了解炎症与癫痫发生发展的关系,对于MTLE发病机制研究有着重要意义。 髓样受体蛋白8(Myoloid-Related Protein8, MRP8)是近年炎症研究领域逐渐被关注的新星,它是S100家族的一员,在炎症过程中表达于激活的粒细胞和巨噬细胞,并被认为是多种炎症相关性疾病中的前炎症标志蛋白。促炎因子白介素-1β (interleukin-1β, IL-1p)在癫痫患者及癫痫模型鼠的海马内均有高表达,并被认为在癫痫进展过程中起重要作用。IL-1p可由反应性星形胶质细胞(Astrocyte, AS)诱导产生,继而诱发下游的炎症瀑布反应。而这种持续炎症反应的存在,对癫痫向慢性自发发作转变,起着重要作用。然而,什么因素导致AS活化进而分泌IL-1p引发炎症反应?MRP8是否与IL-1p分泌有关?IL-1p通过什么途径促进MTLE进展呢?目前未见详细报道。本研究立足于炎症与MTLE发病机制的相关性研究,尝试从炎症来源以及炎症促MTLE进展的作用机制入手,寻找MTLE慢性自发发作的可能原因,以期为今后通过干预发病机制减缓或阻断难治性MTLE慢性进程、改善MTLE预后提供新视角。 研究方法: 本研究分为三部分: 1.以25日龄Sprague-Dawley (SD)大鼠为实验对象,用匹罗卡品腹腔注射诱导实验鼠癫痫发作,制作MTLE大鼠模型。致痫后连续观察8周,有癫痫自发发作的模型鼠被纳入实验,并对纳入的模型进行鉴定,鉴定内容包括:模型鼠行为学改变、脑电图(Electroencephalography, EEG)改变,尼氏染色观察神经元丢失情况,以及Timm染色观察海马神经元苔藓样出芽等;无菌条件下取新生48h内SD鼠大脑,分离大脑皮层和海马分别用于星形胶质细胞(astrocyte, AS)和神经元的培养。利用胰酶消化法获得单细胞悬液,经重复传代,获得体外培养的高纯度原代AS;利用差率贴壁和神经元培养专用Neurobasal+Glutmax+B27无血清培基培养,获得体外培养的高纯度原代海马神经元。分别用胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Portein, GFAP)和微管结合蛋白2(Microtubule Associated Protein2, MAP2)进行AS及神经元鉴定。 2.运用免疫印迹(Western Blot, WB)、荧光定量RT-PCR (Real time quantitative RT-PCR, qPCR)、电泳迁移率变动分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)、酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)、免疫组织化学(Immunological Histological Chemistry, IHC)、间接荧光免疫双标法等实验方法检测MTLE患者及MTLE模型鼠海马组织内髓样相关蛋白(Myoloid-Related Protein8, MRP8)、Toll样受体-4(Toll-like receptor4,TLR4)、核因子-kappa B (Nuclear factor-kappa B, NF-κB)以及IL-1β的表达变化。利用MRP8刺激体外培养的AS,运用Lipo2000脂质体转染发卡样小干扰RNA (Hairpin siRNA, shRNA)使TLR4沉默、二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)预处理阻断NF-κB,检测TLR4、NF-κB以及IL-1p的表达变化及相互作用关系。 3.运用WB、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, co-IP)、FM4-64荧光标记等方法检测MTLE患者及MTLE模型鼠海马组织内磷脂酰肌醇3激酶-p85亚基(Phosphatidyl Inositol3-kinase-p85, PI3K-p85)、磷酸化的丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶(Serine/threonine protein kinase, Akt)、磷酸化的靶蛋白核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6kinase, p70S6k)以及与白介素-1受体(Interleukin-1receptor, IL-1RI)结合的PI3k-p85的表达变化,并运用IL-1p刺激体外培养的原代神经元,运用慢病毒转染shRNA使PI3K-p85沉默、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白((Mammalian Target Of Rapamycin, mTOR)抑制剂Rapamycin预处理阻断mTOR、PP2抑制p85向IL-1RI募集等方式预处理神经元,检测PI3K-p85、与IL-1RI结合的PI3k-p85、p-Akt、p-p70S6k以及MAP2在神经元内的表达变化及相互作用关系;利用FM4-64染色观察各组神经元突触胞吞情况。 研究结果: 1.匹罗卡品腹腔注射可以诱导SD模型鼠出现癫痫发作及癫痫持续状态(status epilepticus, SE),并经过一段无惊厥发作的潜伏期后,模型鼠出现癫痫慢性自发发作。EEG呈现典型癫痫样放电;尼氏染色显示在急性期CA1区和慢性期CA1区、CA3区、DG区有神经元脱失以及变性、胶质细胞增生(与对照组比较,P0.05); Timm染色显示慢性期模型鼠海马组织CA3区及门齿区可见异常苔藓纤维出芽,异常兴奋环路形成(与对照组比较,p0.05)。体外培养的AS经GFAP鉴定,纯度在98%以上;体外培养的神经元,经MAP2鉴定,纯度在95%以上。 2.发现MTLE患者海马组织内MRP8、TLR4、NF-κB以及IL-1β的表达增加(与对照组比较,P0.05)。MTLE大鼠海马内MRP8、TLR4、NF-κB以及IL-1p在急性期和慢性期表达增加(与对照组比较,p0.05),而潜伏期表达仅轻微增加(与对照组比较,p0.05)。利用MRP8刺激体外培养的AS,细胞内的TLR4、NF-κB以及IL-1p表达增加(与对照组比较,p0.05),并且NF-κB由胞浆向胞核内转移,IL-1β在细胞上清液中含量增加(与对照组比较,p0.05);抑制TLR4可以下调MRP8所致的NF-κB和IL-1p表达增加(与MRP8组比较,p0.05)以及NF-κB向胞核内转移;抑制NF-κB只能下调MRP8所致的IL-1p表达增加(与MRP8组比较,p0.05)。 3.发现MTLE患者海马组织内PI3K-p85、p-Akt、p-p70S6k以及与IL-1RI结合的PI3K-p85表达增加(与对照组比较,p0.05)。MTLE模型鼠海马内上述蛋白在急性期、潜伏期和慢性期表达均增加(与对照组比较,p0.05)。利用IL-1p刺激体外培养的海马神经元,细胞内PI3K-p85、p-Akt、p-p70S6k、MAP2以及与IL-1RI结合的PI3K-p85表达均增加(与对照组比较,p0.05),并且神经元突触的胞吞作用明显加剧(与对照组比较,p0.05);抑制PI3K-p85可以下调IL-1β所致的p-Akt、p-p70S6k(?)口MAP2表达增加(与IL-1p组比较,p0.05),神经元突触的胞吞作用减弱(与IL-1β组比较,p0.05);抑制mTOR也能下调IL-1β所致的PI3K-p85、p-Akt、p-P70S6K和MAP2表达增加(与IL-1β组比较,p0.05),神经元突触的胞吞作用减弱(与IL-1β组比较,p0.05);抑制p85亚基与IL-1RI的结合也可以下调IL-1β所致的p-Akt、p-P70S6K和MAP2表达增加(与IL-1β组比较,p0.05)。 研究结论: 1.成功诱导出具有慢性自发发作的幼鼠MTLE模型,并在体外培养出了高纯度的原代AS和原代海马神经元。 2.炎性标志物MRP8通过TLR4/NF-κB/IL-1β信号途径开启了MTLE发病过程中促炎因子释放的进程。 3.促炎因子IL-1β通过IL-1RI与PI3K-p85结合使PI3K-p85活化,进而磷酸化Akt和mTOR下游物质p70S6k,促进神经元突触增生及活化,这可能是MTLE向慢性化进展的机制之一。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R742.1

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