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《中南大学》 2014年
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miRNA-124靶向调控PPP1R13L抑制胶质母细胞瘤增殖和侵润

赵卫华  
【摘要】:背景和目的: 目前,肿瘤是危险人类生命健康的头等杀手。胶质母细胞瘤是星形细胞肿瘤中恶性程度最高的胶质瘤,属于WHO IV级,是一种最常见最致命的中枢神经系统肿瘤之一,年发生率为4.96/100,000,占所有胶质瘤里面的50%。目前的传统性的治疗手段包括外科手术、放疗和化疗以及其它综合性的治疗。虽然过去对于胶质母细胞瘤的治疗已经取得了很大的进步,但是胶质母细胞瘤患者的生存率依然很低。由于胶质母细胞瘤存在于大脑皮层的白质这种特殊的位置,并且由于胶质母细胞瘤生长速度快、侵润性强,因此患者病程短,平均存活周期只有大约15个月左右,胶质母细胞瘤患者经诊断后大约95%未经治疗的患者生存期不超过3个月。因此,发展更有效的诊断和治疗手段对胶质母细胞瘤进行治疗刻不容缓。过去大量的研究表明,胶质母细胞瘤的发生和发展和一个复杂的过程,主要涉及到细胞内部原癌基因或者抑癌基因的表达失调,进而导致细胞内信号通路调控的异常激活或者失调。因而,进一步阐明在胶质母细胞瘤的发生发展过程中的分子机制将对胶质母细胞瘤的诊断、预防和治疗就显得非常重要。尽管过去对于胶质母细胞瘤在分子水平上的发生机制进行了大量研究并取得了很多成果,但是对于胶质母细胞瘤的具体分子发生机制仍然大部分不为人知。 MicroRNA是一类非编码的小分子单链RNA, Lee等于1993年首次在线虫中发现microRNA,并发现其参与了对新秀丽线虫的胚胎后发育的调节。后来在多种物种包括动物,植物中都发现了microRNA的存在。人类中也发现了多达400多种microRNA的存在,据估计可能在人类中存在多达1000种的microRNA。 MicroRNA通过与靶基因mRNA序列的3’非翻译区或者编码区内含子区域的特异结合,影响靶基因mRNA的稳定性,或者可以直接抑制靶基因的蛋白翻译,进而调节靶基因的表达。累积的研究表明,MicroRNA作为一种重要的调节因子,参与了对细胞分化、增殖、凋亡和代谢等生理过程。由于microRNA对于正常细胞生理活动调节的重要性,一旦microRNA的调节失控将引起一系列的分子事件,导致正常细胞细胞周期、增殖、转移和侵润等生物学行为改变,促进细胞恶性转化,导致肿瘤的生成和发展。因此通过microRNA干预胶质母细胞瘤的发生以及增殖将成为未来治疗胶质母细胞瘤的一种新的策略。 MicroRNA-124是一个在神经系统中表达很丰富的miRNA,参与了对神经系统发育,代谢等重要的生理过程的调节。在本文的研究中,为了确定microRNA-124在调节胶质母细胞瘤分化和增殖、侵润过程中的作用,首先通过比较分析microRNA-124在胶质母细胞瘤组织和正常脑组织的表达差异,然后通过生物信息学对microRNA-124在胶质母细胞瘤细胞中潜在的靶基因进行了分析,并进一步分析了microRNA-124以及靶基因PPP1R13L对胶质母细胞瘤细胞的分化和增殖的调节。 方法和结果: l.microRNA-124在胶质母细胞瘤组织中表达显著下降:通过实时定量Real-time PCR方法,我们检测了9例胶质母细胞瘤组织以及7组癌旁脑组织中microRNA-124的表达水平,结果表明,与癌旁脑组织相比,microRNA-124在这9例胶质母细胞瘤组织中的表达都显著性的下调,下降幅度基本上都达到几乎3.5倍,说明microRNA-124在胶质母细胞瘤组织中表达显著下降了。 2. microRNA-124负调控了靶基因PPP1R13L的表达:通过采用生物信息学软件TargetScan对PPP1R13L基因mRNA的3’非翻译区进行了潜在microRNA结合位点分析,发现PPP1R13L基因mRNA的3’非翻译区存在两个microRNA-124结合位点,其中一个位点位于人PPP1R13L基因mRNA的3’非翻译区下游约180bp处,在多个物种之间都存在高度保守性。为了进一步验证microRNA-124能否直接调节PPP1R13L基因,我们构建了包含PPP1R13L3'非翻译区野生型全长序列、保守结合位点突变序列突变体的荧光素酶报告基因载体。通过荧光素酶报告基因检测实验证明了,microRNA-124能够显著的抑制包含PPP1R13L3'非翻译区野生型全长序列的报告基因的表达,但是对包含保守结合位点突变序列突变型载体的报告基因的表达没有影响。通过RT-PCR实验证明了,在胶质母细胞瘤细胞系U251和U373细胞系中,microRNA-124能够显著的抑制PPP1R13L的mRNA水平。进一步通过Western blot实验证明了,在胶质母细胞瘤细胞系U251和U373细胞系中,microRNA-124能够显著的抑制PPP1R13L的蛋白水平。以上的结果说明,PPP1R13L作为microRNA-124的直接靶基因,被其负调控。 3. microRNA-124靶向PPP1R13L抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖:通过MTT实验和克隆形成实验,发现相比于过表达对照组,过表达microRNA-124能够极大的降低胶质母细胞瘤细胞U251和U373的增殖,而过表达microRNA-124抑制物能显著的增加胶质母细胞瘤细胞U251和U373的增殖。说明microRNA-124靶向PPP1R13L抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖。 4. microRNA-124靶向PPP1R13L抑制胶质母细胞瘤细胞的细胞周期运转:通过流式细胞技术,发现相比于对照组,过表达microRNA-124能够极大的抑制胶质母细胞瘤细胞U251和U373的细胞周期从G1期进入S期,而过表达microRNA-124抑制物能显著的促进胶质母细胞瘤细胞U251和U373的细胞周期从G1期进入S期。说明microRNA-124靶向PPP1R13L抑制胶质母细胞瘤细胞的细胞周期从G1期进入S期。 5. microRNA-124靶向PPP1R13L抑制胶质母细胞瘤细胞的侵润:通过Transwell小室实验,发现相比于对照组,过表达microRNA-124能够极大的抑制胶质母细胞瘤细胞U251和U373的侵润,而过表达microRNA-124抑制物能显著的促进胶质母细胞瘤细胞U251和U373的侵润。同时,也发现过表达microRNA-124抑制了U251和U373细胞中的MMP-9和MMP-13的表达,过表达microRNA-124抑制物促进了U251和U373细胞中的MMP-9和MMP-13的表达。说明microRNA-124靶向PPP1R13L抑制胶质母细胞瘤细胞的侵润。 主要创新点: 1.首次通过Real-Time PCR证明了microRNA-124在胶质母细胞瘤组织中低表达。进一步提示microRNA-124作为胶质母细胞瘤的诊断标记物。 2.首次证明microRNA-124通过靶向PPP1R13L抑制胶质母细胞瘤细胞的生长、增殖和迁移。进一步证明了microRNA-124可作为胶质母细胞瘤的干预治疗靶点。 结论: 本研究证明了microRNA-124在胶质母细胞瘤中低表达,并且证明了PPP1R13L为microRNA-124负调节的靶基因,进而阐明了micorRNA-124通过靶向调节PPP1R13L抑制胶质母细胞瘤细胞的生长、增殖和侵袭的分子机制,发现microRNA-124在胶质母细胞瘤的发生发展过程中扮演重要的生物学作用,暗示microRNA-124可能作为以后治疗胶质母细胞瘤的诊断标记和治疗靶点。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R739.4

【参考文献】
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