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《中南大学》 2003年
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氧化铁磁性纳米转运体系的研制及其在体内外基因转运中的应用

向娟娟  
【摘要】: 基因治疗在恶性肿瘤治疗的地位越来越受到重视,有望成为化疗、放疗和手术治疗之后的又一常规治疗手段。高效的基因转移和基因的表达是基因治疗的关键技术。目前的基因载体包括多聚阳离子聚合物、脂质体及其衍生物和病毒载体。目前大约三分之二的肿瘤基因治疗的临床试验是应用病毒载体来转运目的基因。但是病毒载体存在着很多难以克服的缺点,如:病毒载体具有免疫原性,细胞毒性,缺少组织特异性,不能装在大片段的DNA,具有潜在的致瘤性,在病毒重组过程中产生活性的病毒颗粒以及在外周血中被迅速清除。所以非病毒载体的研究日益受到重视。然而,目前应用的非病毒载体,如多聚阳离子聚合物和脂质体,存在着转染效率低,尤其在体内的转染效率低等缺点。缺乏高效,安全,靶向的基因载体已成为了基因治疗常规应用的主要障碍之一。因此寻找新的非病毒载体成为目前的研究热点。目前非病毒载体的研究已不局限于阳离子聚合物材料,其他的多种材料,如:无机化合物都成为了研究对象。无机化合物的制作工艺相对简单,造价低廉。这一类材料制成的基因载体多发挥着“工作台”的作用,装载目的基因的DNA和其他生物物质的进入细胞内。 本研究项目结合目前新兴的纳米材料科学和分子生物学,自组装了一种多聚赖氨酸修饰的氧化铁磁性纳米颗粒(poly-L-Lysine modified iron oxide nanoparticles,IONP-PLL)。通过体内外实验验证了IONP-PLL作为基 博士学位论文 因载体的可行性,以及通过条件优化,使这一转运体系的转染效率达到 一较高水平。尤其是利用其能携带外源基因通过血脑屏障这一特性将其 应用于脑胶质瘤的基因治疗研究。 应用二价和三价铁在高浓度的葡聚糖体系中共沉淀制成分散状态良 好的小颗粒悬浮状态的氧化铁磁性纳米颗粒(iron oxide nanoParticles, IONP、电镜检测显示氧化铁纳米颗粒直径约20urn士4.sum左右,分布均 匀。作为基因载体,与DNA的结合能力是必备条件之一。应用凝胶阻滞 实验和 DNA共沉淀实验来评价L 的 DNA结合能力。结果显示,该纳米 颗粒在pH-3日可以结合不保护DNA,但是在叫-7和9日就丧失了这种能 力。我们认为 IONP的 DNA结合能力是基于一种电负性 DNA磷酸骨架和 10NP的正电性之间静电结合。ZETA电位检测显示在d司,10NP的表面 电性为正性(6.3士0.36),可以结合电负性的mA。在州=7和 9时,10NP 的表面电性为中性u.1士1.0)至负性(-9.6士0.91人 因此不能结合 电负性的 DNA。以上结果说明,表面电性为十 6左右对于 IONP己足够结 合电负性的DNA。纳米颗粒对于DNA的保护能力也是由于这种静电引力。 因此为了符合生理条件下的(PH 7.35-7.45)DNA结合和保护,我们 在氧化铁纳米颗粒的表面修饰多聚赖氨酸,成为IONP干LL。该纳米颗粒 粒径小,在生理条件下 ZETA电位为屹.7士0.36,凝胶阻滞实验和 DNA共 沉淀实验证实IONP干LL在生理条件下可以结合mA。同时结果显示随着 体系中的IONP干LL的增加,其DNA的结合力越来越强,体系中游离的DNA 越来越少。说明mA是结合到10NP干LL的表面。这种表面结合力也可保 7 博士学位论义 一 护洲A抵御核酸酶的降解。电镜显示IONP干LL的直径为58urn士14urn,负 染色显示出结合于N 干LL表面的DNA。我们应用MTT试验来检测 10NP-PLL,IONP-PLL/DNA复合物在不同细胞系MH/3T3,COS7。U251和 Hela的细胞毒性。MTT试验显示IONP-PLL和工ONP-PLL/DNA的细胞毒性 刁 小。 除了与DNA的结合能力以外,能够进入细胞,在细胞胞浆和胞核分 布也是基因载体的必备条件。电镜检测和不同时间的体外细胞普鲁士蓝 染色实验结果显示细胞可以吞噬m 干LL,在细胞的胞浆和胞核分布以 及L 干LL进入细胞的过程。以编码绿色荧光蛋白的报道基因EGFP{ 和编码荧光素酶的报道基因PGLZ-CONTROL为目的基因,以IONP-PLL为 转染载体转染4种不同的细胞株。结果显示,N 干LL可携带外源基因 在各种细胞中分布并表达出目的蛋白。在10NP干LL与外源基因质量比为 I:2时,转染效率达到最高。不同细胞转染的效率各不相同。 除了环状质粒DNA以外,反义线性寡核昔酸选择性地调节基因表达 在基因治疗中也有重要的意义。在线性寡核昔酸的另一端修饰荧光物质 FHC。用荧光显微镜和流式细胞分析仪检测荧光信号,结果显示IONP干LL 可以将线性寡核昔酸高效地携带至细胞内。 9 将工ONP-PLL结合外源质粒 DNA形成复合物,将复合物从 BALB/C /J’ 鼠尾静脉注射进入小鼠体内,应用电镜
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R-39

【引证文献】
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【参考文献】
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【同被引文献】
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