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《中南大学》 2003年
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人Fas Ligand cDNA的克隆、表达对HepC_2细胞系细胞凋亡影响

陈军  
【摘要】: 人Fas Ligand cDNA的克隆、表达对HepG_2细胞系细胞凋亡影响 细胞凋亡(apoptosis)与肿瘤的发生、增殖与转移有着较为密切的关系,而Fas/Fas配体(Fas Ligand,FasL)被认为是传导细胞凋亡信号的“死亡信号传递分子”。其中Fas L主要存在于免疫活性细胞,通过与靶细胞Fas结合,导致靶细胞凋亡。为研究Fas L在肝癌细胞凋亡过程中的作用,我们首先采用ELISA法对慢性乙型肝炎、肝炎肝硬化与肝癌患者血清可溶性Fas L(sFasL)水平进行了初步检测,结果显示sFasL在肝癌患者明显低于肝炎及肝硬患者;提示在肝癌的发生中,FasL及Fas与肝癌细胞凋亡有重要关系。 为进一步研究,我们首先构建了人Fas L的真核表达重组体pcDNA3.1hisB-Fas L:根据人FasL的cDNA核苷酸序列及表达载体的特点,设计、合成两对基因序列特异性引物,从外周血单个核细胞中抽提总RNA作模板,通过RT-PCR扩增得到人成熟Fas L的cDNA片段。然后将Fas L cDNA克隆入pGEM-T Easy Vector,形成表达中介重组体PGEM-Fas L,接着把目的片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1hisB。构建的表达重组体pcDNA3.1hisB-Fas L经PCR和限制性酶切消化有预期的目的片段出现,DNA序列分析证实Fas L完整、正确插入。 为检测Fas L的生物学活性,我们采用脂质体转染法将pcDNA3.1hisB-Fas L转染至人肝癌细胞株HepG2细胞,经免疫组化检测HepG2细胞FasL表达呈阳性;通过ELISA检测,培养液上清检测到微量sFasL;而对照组FasL表达呈阴性,培养液上清未检测到微量sFasL,表明FasLcDNA已成功转染入肝癌细胞系HepG2并已得到表达。将转染后的HepG2细胞与HepG2.2.15共同培养24小时后,采用Annexin V/PI双染后双变量流式细胞仪检测细胞凋亡率,结果显示细胞凋亡率为36.30%;未转染FasL的对照组细胞凋亡率11.53%。 因此,在本实验中,我们已成功完成了人FasL cDNA的克隆、表达;并使肝癌细胞实现了不依赖细胞毒性T细胞(CTL)、以Fas-FasL介导的细胞凋亡,为进一步研究Fas/FasL在肝癌中的作用奠定了基础。
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