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17β-雌二醇对人成骨样细胞和破骨样细胞作用机制的研究

王运林  
【摘要】: 17β-雌二醇对人成骨样细胞和破骨样细胞作用机制的研究 绝经后骨质疏松症是原发性骨质疏松症中的最常见类型,妇女在绝经后早期存在一个骨量丢失的加速期,与雌激素水平快速下降有关。大量文献资料表明,雌激素可改变炎性因子和/或其受体在成骨细胞和破骨细胞中的表达,如上调护骨素(OPG)下调其配体RANKL在成骨细胞表达;改变白介素1(IL-1)介导的成骨细胞IL-6及IL-11表达;雌激素也可抑制破骨细胞蛋白酶表达。但雌激素对这些调节因子的作用机制和雌激素缺乏时这些因子的变化特征仍未阐明。因此我们从人骨巨细胞瘤组织中分离、纯化出具有破骨细胞表型特征的多核巨细胞,并用17β-雌二醇(17β-E_2)干预,观察破骨样细胞中破骨细胞分化因子受体(RANK)、组织蛋白酶K(CK)、降钙素受体(CTR)表达量的变化。最后,以具有成骨细胞表型的人成骨肉瘤MG63细胞株为研究对象,采用RT-PCR,Northern blot和Western blot方法,从基因和蛋白质水平观察17β-雌二醇(17β-E_2)干预后,MG63细胞IL-6、IL-11的表达特征,以及MG63细胞NF-κB表达水平的改变,旨在探讨17β-E_2调节骨代谢的途径。本系统研究得出以下结论: (1)人骨巨细胞瘤组织是较好的破骨样细胞来源,可分离纯化出大量具有破骨细胞表型特征的细胞,是进行破骨细胞研究的较好细胞来源。(2)17β-E_2可下调破骨样细胞CK的表达,而对RANK和CTR表达量无明显作用。(3)17β-E_2在基因水平下调MG63细胞IL-6和IL-11的表达。(4)NF-κB是17β-E_2作用后介导MG63细胞IL-6表达的信号途径,17β-E_2可下调其表达。 中南大学 博士学位论文 第一部分 一种新的纯化人破骨样细胞方法 目的:从人骨巨细胞瘤组织中分离纯化并鉴定破骨样细胞。 方法:利用破骨细胞贴壁快及细胞体积大的特点,取瘤组织置于含的a-MEM 培养液中,经100目过滤网过滤,将上清液转移至25cm‘培养瓶。于37oC,5%CO。 培养箱中培养1-2小时后,弃培养液:lxPBS清洗数次;0.25%胰酶-EOTA 37℃ 消化5分钟,加入含川%FBS的a-MEM,经小25tim过滤网过滤;IX PBS清洗末 过滤细胞,即得到纯化的破骨样细胞,并进行细胞形态学和分于生物学鉴定。 结果:该方法所得细胞纯度可达80.l%,具有成熟破骨细胞的表型特征,如 抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色)及酸性磷酸酶染色阳性、降钙素反应、 溶骨作用,可表达降钙素受体、组织蛋白酶K和 RANK。 结论:该方法所得破骨样细胞可用于生化和分子生物学研究;;是进行破骨细 胞研究较好的细胞来源。


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