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《中南大学》 2003年
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GJB1、GAD、GIRK1在颞叶癫痫大鼠海马内源性促痫与抗痫机制中作用的研究

龙小艳  
【摘要】: 目的: 癫痫是脑内兴奋-抑制失衡、神经元异常放电所致的慢性脑部疾病。颞叶癫痫是成年期最常见的难治性癫痫之一,对颞叶癫痫的深入研究有助于了解难治性癫痫的发生机制。颞叶癫痫演变过程中脑内存在着复杂的内源性促痫与抗痫并存机制。迄今,对内源性促癫痫机制研究较多,而对促痫与抗痫并存机制研究很少。GABA在维持脑内兴奋-抑制平衡中起重要作用,谷氨酸脱羧酶(GAD)是GABA的合成限速酶,其分布与GABA平行,GAD65与GAD67是GAD的两种亚型,GAD65与GAD67的共同表达情况可以反映脑内GABA能抑制系统的功能状态;G蛋白藕合的内向整流钾(GIRK)通道是钾通道的一种,活化后产生的GIRK电流有维持神经元细胞膜静息电位的稳定及产生突触后抑制电位的作用;GJB1是缝隙连接蛋白的一种,主要由GJB1形成的缝隙连接参与了神经元的快速同步放电的过程。迄今,在不同癫痫模型或在癫痫的不同时期观察到的海马GAD65和/或GAD67表达变化的结论不一,因而其意义尚难确定,而对颞叶癫痫海马GJB1、GIRK1表达的变化研究较少,故本研究在海人酸致痫同一模型的不同时期,联合观察GJB1 mRNA、GAD65 mRNA及其蛋白、GAD67蛋白、GIRK1mRNA及其蛋白在海马齿状回、CA1、CA3区表达的动态变化过程,系统探讨GJB1、GAD65、GAD67、GIRK1在颞叶癫痫发生后海马内源性促痫与抗痫机制中的作用。 方法: 1.模型制作及分组 随机将体重为 1802 的 6七周龄健康雄性 SD大鼠门 2只分为: 实验组(A组,n叶0L对照组m组,n=42人 两组又各均分为7个 亚组(A;,亚组,n叫;B;,亚组,n=6人B组额叶癫痫模型制作选 用海人酸N.4mglml)腹腔注射法,14mg/kg;A组大鼠腹腔注射无 菌生理盐水,14mghg。选取腹腔注射后 3 ’J\时、6 ’J\时、门小时、 24小时、48小时、7天、30天为研究的时间点,颜叶海马的CAI区、 CA3区、齿状回为研究部位。腹腔给药后每天观察大鼠的行为学变化, 根据Racine标准判定癫痈发作的程度,大鼠处死前进行EEG描记。 2.用原位杂交方法检测不同时间点海马不同区域 GJB、GIRK、 GAD65 mRNA的表达。 3.用免疫组织化学漂浮法检测不同时间点海马不同区域 GIRK、 GAD65、GAD67蛋白的表达。 结果: !.本实验海人酸颜叶癫痈模型的制作成功率为79.8%,与文献报 道的模型制作成功比较差异无显著性意义。 2.GJBlrnRNA、GAD65InRNA及其蛋白、GAD67蛋白、GIRKI InRNA及其蛋白不仅在两组大鼠海马 CA、CA3区锥体细胞表达, 而且在齿状回颗粒细胞表达,GJB卜GAD65、GIRKI原位杂交染色 阳性细胞胞浆呈棕黄色至深褐色,GAD65、GAD67免疫组化染色阳 性细胞胞浆及GIRKI免疫组化染色阳性细胞胞膜呈紫蓝色。 3.海人酸致痈后 3小时,实验组大鼠海马各区 GJB mRNA表达 与对照组比较差异无显著性意义0 e 0刀5);致痫后 6小时,实验组 大鼠海马各区 GJB tnRNA表达较对照组增高o t 0刀5人 至致痈后 Ill 12小时-30天,显著增高(Pwto.of)。 4.实验组大鼠海马GAD65 m洲A及其蛋白的表达随时间呈逐渐 增高趋势,致痈后48 ’J\时上0天,GAD65 mRNA及其蛋白表达较对 照组增高(48刁时Pwto *5;7.30天Pwto *1)。 5.两组大鼠海马各区均可见GAD67蛋白表达,海人酸致痫后6 小时、24小时实验组大鼠海马的GAD67蛋白表达较对照组增高(分 别为Prto.of、Prto.05人 以6小时时显著,约为对照组的2.6上.0倍, 24小时时约为对照组的1.5倍。 6.海人酸致痈后 6 小时,实验组大鼠海马 CA、CA3 区 GAD67们AD65 的比率较对照组升高o.of入 海人酸致痫后 30 天,实验组大鼠海马齿状回 G皿67/GAD65的比率较对照组降低(P t 0刀5)。 7.实验组大鼠在海人酸致痈后36/J’时海马齿状回GIRKI mRNA 表达有下降趋势,6 ’J’时时与对照组比较 GIRK mRNA表达减少o wto刀1入 致痈后 12’J’时l0天,海马齿状回GIRKI mRNA表达呈逐 渐增高趋势,至7上0天时G!RK IInRNA表达增高o<0.05人 海人 酸致痛后海马各时间点 CA、CA3区 GIRK mRNA表达与海马各区 GIRK蛋白表达与对照组比较差异无显著性意义0 o 0刀5人 两组大鼠在腹腔注射后任一时间点 GIRK mRNA及其蛋白在海 马齿状回的表达较 CA、CA3区高(P t 0.of人 8.两组大鼠在腹腔注射后任一时间点,GAD65m洲A及其蛋白、 GJB mRNA、GAD67蛋白在海马齿状回、CA区、CA3区之间的表 达差异无显著性意义0 n 0.05人 9.额叶癫痴慢性期齿状回颗粒细胞内 GJB mRNA 与 mRKI<RNA的表达呈负相关,相关系数为心.823,*一0刀01<0刀卜 IV GAD65mRNA及其蛋白与GJBlmRNA或GIRKlmRNA 的表达之间 无相关关系0 刀5人 结论: 1.颗叶癫痫大鼠海马 GJB表达的增高可能是癫痫发生后机体的 一种内源性促癫痈发生机制。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R742.1

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