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《中南大学》 2003年
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神经干细胞移植治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤

王霞  
【摘要】: 尽管当今围产期监测、孕期和新生儿监护等方面的医疗技术取得了长足的发展,但近十年来,新生儿缺血缺氧性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)的发生率却无明显降低,平均每1000个活产足月儿中,就有3~4个婴儿发病,早产儿的发病率更高,其中10%~60%在新生儿期死亡,25%以上的患儿遗留永久的神经心理缺陷,如脑瘫、精神发育迟滞、学习困难和癫痫。而且,目前的治疗仅局限于支持疗法,而没有直接阻止脑损伤进程或促进损伤神经再生的措施。神经组织或细胞移植为恢复损伤的神经系统功能提供了有希望的新途径。在最开始的移植研究中,研究者多采用胎脑组织或细胞作为移植的供体,胎脑组织具有抗原性低和能够无氧代谢等特点,移植后易于存活,并能与宿主脑整合,可产生较好的治疗效果。但胎脑组织移植要求“点对点”移植,不同的移植部位需要来源于相对应部位的脑组织,否则就不能形成正常的纤维投射, ———— 而且胎脑组织来源有限,还面临着医学伦理学的问题,临床应用受限, 因此近年来人们致力于寻找其他的供体。癌细胞系和永生化的细胞系 移植治疗缺血性脑损伤也取得了良好的疗效,但由于细胞类型单一而 且存在致癌危险性也限制了它的使用;骨髓基质细胞出one marrow sromal cells,BMSCs)移植可明显改善脑损伤后的神经功能缺陷, 由于其分化为神经细胞的比例低,其治疗机制认为主要与其分泌的多 种细胞因子有关。BMSCS移植后能否分化为有功能的神经元,目前 尚无定论,而且移植后会在脑内遗留许多非神经系统的细胞,作为移 植的供体,其利弊还需进一步斟酌。神经干细胞(neural stem cells, NSCS)可在体外传代、长期培养、大量增殖,也可低温保存而维持 其末分化、未成熟、多潜能的特性不变,经体外诱导可以分化为各种 成熟的神经细胞表型,如神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞等; NSCS脑内移植后,不仅可以在脑内发育、分化、成熟形成有功能的 神经元,而且还能长期存活,接受局部的信号分化为相应的神经元, 与宿主脑建立起复杂的神经联系。至今为止,尚未见NSCS脑内移 植形成肿瘤的报道。NSCS作为脑移植的供体,克服了上述供体细胞 的局限性,不难看出,NSCS在脑损伤的治疗上具有广阔的应用前景。 目前,在使用 NSCS移植治疗缺血性脑损伤的动物实验和临床 实验中,均己取得了一定的疗效,但是这些研究结果大多来自于成年 动物和成年人,治疗新生动物模型少见。由于成年期动物宿主对移植 物的反应与新生期动物是不同的,因此,NSCS移植对治疗 HIE是 否有效尚需进一步研究。 1二 一 本研究旨在观察NSCs移植对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤 (hypoxic-ische加c brain damage,HIBD)模型神经行为和脑组织病 理学的影响,以期为NSCs移植治疗新生儿HIE提供实验与理论依 据;同时对脂质体介导外源性基因导入NSCs的条件进行优化,为 NSCs作为基因治疗载体提供实验依据。 研究包括以下三部分。 一、大鼠胚胎神经于细胞的分离培养及鉴定 目的 建立胎鼠神经干细胞的分离、培养及分化鉴定技术;观 察NSCs 的生长、增殖及分化的特点。方法 分离胎龄 14 d的 Sprague-Dawlcy侣D)大鼠胚胎前脑皮质,经消化及机械吹打后采用 无血清悬浮培养的方法获得细胞克隆。应用间接免疫荧光方法,鉴定 NSCs和分化的神经细胞。结果 从SD大鼠胚胎前脑皮质分离的组 织经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并具有增殖的能力。原代和 传代细胞抗原nestin呈阳性。分化后的细胞可表达神经元和星形胶质 细胞的特异性抗原NF七00和GFAP。结论 胎鼠NSCs具有自我更新 和分化潜能,有很强的增殖能力,经体外培养能够分化成为神经元及 星形胶质细胞。 二、绿色荧光蛋白转染胚鼠神经干细胞 目的 探索脂质体介导目的基因转染NSCs的最佳条件,为 NSCs移植研究提供追踪的方法,为NSCs作为基因治疗的载体提供 实验依据。方法 分离培养胚胎大鼠NSCS,使用pEGFP(。作为报 道基因,5脂质体Lipofectamne 2000一起转染NSCs,观察脂质体 ill 扛 一 转染后绿色荧光蛋白的表达的量效与时相关系;筛选稳定表达绿色荧 光蛋白(reen luorescent protein,GFP)的细胞克隆,观察其生长特 性:将筛选出的细胞克隆用立体定位仪植入新生*D大鼠侧脑室内, 观察绿色荧光蛋白的表达。结果 使用脂质体Lipofectalnine 2000 介导绿色荧光蛋白质粒转染NSCs,转染时间在5~8小时左右,脂 质体(卜1)/**A(卜9比值在1二与1:2之间,*FP表达高峰在 转染48小时左右;转染GFP基因的NSCS的生长特性无明显改变, 诱导分化后仍然能有效表达GFP,移植到新生SD大鼠侧脑室后,在 体内也可有效表达GF
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R722.121

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【参考文献】
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