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《中南大学》 2003年
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hFIX基因的内含子I对FIX表达的增强作用

刘慕君  
【摘要】: 血友病B是X-连锁的隐性遗传疾病,是由于凝血因子IX缺乏引起。近十年来,血友病B基因治疗的研究虽取得了一定的成绩,但其表达时间短、表达量低的问题仍未得到有效解决。 表达时间短主要是因为FIX的表达不稳定,这与基因治疗载体有关,现有的基因治疗一般都采用病毒载体,而病毒载体转染细胞后,其插入基因组DNA的效率不高,部分载体以附加体的形式存在于细胞核内,不能随细胞的分裂而稳定遗传,从而导致FIX基因不能长期稳定的表达。我室构建的以双随体小染色体(bisatellite microchromosome)的部分特异性片段为基因打靶引导序列的人源基因载体,因其引导序列与D、G组染色体短臂同源,具有定点整合到D、G组染色体短臂上的能力,从而可解决FIX表达时间短的问题。但是,当我们将含有FIX cDNA的人源基因载体,转染HT1080后发现:FIX的表达虽然稳定,但FIX的表达量难以达到临床治疗的要求。因此,提高FIX的表达量是我们进行血友病B基因治疗的另一个关键问题。 hFIX基因的内含子I是近些年来屡见报道的能增强FIX表达的顺式作用元件。在血友病B基因治疗的研究中,已有人将hFIX基因的内含子I用于病毒载体来提高FIX的表达量,并取得了一定的成效。本研究构建了hFIX基因的两种缺失型内含子I,并导入以hCMV启动子、BGHpolyA为表达元件的pGEM-T载体骨架及人源基因载体中,研究hFIX基因的内含子I对FIX表达的增强作用,特别是在人源基因载体中,其对FIX表达的增强作用,以达到FIX稳定、高效表达的目的。 为了研究hFIX基因的内含子I(IntronI)对FIX表达的增强作用,我们首先利用PCR方法,从正常人皮肤成纤维细胞gDNA中扩增出hFIX基因内含子I相关片段,经过一系列的亚克隆,获得minigeneFIXa及minigeneFIXb,前者插入的内含子(Intron Ia),长度为1.424kb,它缺失了内含子I中段的4.8kb;后者插入的内含子(Intron Ib),长度为299bp,它缺失了内含子I中段的5.93kb。以pGEM-T载体为骨架,含有minigeneFIXa、minigeneFIXb、FIX cDNA的表达载体,测序证实后,经Lipofectamine~(TM)2000转染HT1080细胞,检测瞬时表达产物中的FIX蛋白含量;进一步将minigeneFIXa、minigeneFIXb及其表达元件引入到人源基因载体中(FIX cDNA引入人源基因载体的质粒已构建),挑选正、反向 硕士学位论文hFIX基因的内含子I对FIX表达的增强作用 质粒各一个(把neo基因与minigeneFIX、FIX cDNA的转录方向一致时 的质粒,称为正向质粒;方向相反,则称为反向质粒),测序证实后,酶 切线性化,以电穿孔的方式转染 HT10SO细胞,用筛选浓度为 400 u g地 的 G4筛选 3周,检测混合克隆稳定表达产物中的 FN蛋白含量,并抽 提混合克隆mRNA、gDNA,对其mRNA产物进行RT-PCR检测,gDNA产物进 行外源基因的鉴定。 结果发现:minigeneFIXa和 minigeneFIXb,无论是在瞬时表达还是 在稳定表达中,所表达的FIX蛋白总量及活性叮X量无明显差别。在瞬时 表达中,minigeneFIX所表达的FIX蛋白总量及活性FIX量,*FIX cDNA 所表达的相应量高3A倍;在稳定表达中,正向质粒中的min…eneFIX比 F工X CDNA所表达的 F工X蛋白总量高 3-5倍,活性 FIX蛋白量高 3-4倍;反 向质粒中的minigeneFIX卜FIX cDNA所表达的FIX蛋白总量高15-20倍, 活性Fn蛋白量高20倍以上。盯干R检测混合克隆帕M表达量,得到与 上述相一致的结果。PCR扩增混合克隆细胞gDNA,得到相应大小的外源基 因片段。 这些研究结果表明:1.无论是在以PGEMT载体为骨架的表达载体还 是在人源基因表达载体中,Intronl都能显著增强*X的表达;2.Intron la、*tron fo对FIX表达的增强作用无明显差别;3.在稳定表达中,正 向质粒比反向质粒所表达的FN蛋白总量及活性FIX量都要高,但htron 工在反向质粒中对nX表达的增强作用更显著。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R554.1

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