共振光散射技术测定生物大分子的新方法

【摘要】：随着人类基因组计划的提前完成,生物分析技术进入基因时代。生物大分子(特别是核酸和蛋白质)的检测方法不断发展,成为生命科学的前沿领域。沿用的核酸和蛋白质定量分析方法主要是分光光度法和荧光法,但它们都存在严重的缺陷。分光光度法灵敏度低、干扰多、耗时较长,荧光光度法仅限于荧光体系、且试剂很多有毒或昂贵。至今尚未有一种测定核酸和蛋白质完善的分析方法。共振光散射(RLS)技术是一种新型生化分析方法,灵敏度高、简便快捷、探针类型较多、且有可能继续开发。 研究小分子与核酸的结合反应是近年来受重视的研究方向。因此,对核酸等生物大分子的测定的研究不仅有利于建立新的更有效的分析方法,而且有助于揭示癌症等疾病的病变机理及研制抗癌新药。小分子与核酸结合方式主要有三种:嵌入式、沟槽式和静电引力。 本论文提出并通过实验建立了八种RLS新方法,同时探讨了一些相关的作用机理,具体如下: 第一,四苯基钴卟啉RLS法测定核酸。在实验得到的最佳条件下,核酸能增强四苯基钴卟啉的弱RLS信号,并且增强的RLS强度与核酸浓度成正比。小牛胸腺DNA、鱼精DNA和酵母RNA定量测定的线性范围分别为0.05-3.5μg/mL、0.03-4.2μg/mL、0.02-4.9μg/mL,检测限分别为3.5ng/mL、4.5ng/mL、6.1ng/mL。测定结果满意。该法比黄承志等的卟啉(TAPP)法明显地提高了测定的灵敏度和稳定性。 第二,四苯基铁卟啉RLS法测定核酸。该方法测定核酸的灵敏度比四苯基钴卟啉高。小牛胸腺DNA、鱼精DNA和酵母RNA定量测定的线性范围分别为0.02-2.8μg/mL、0.05-3.3μg/mL、0.07-4.5μg/mL,检测限分别为2.9ng/mL、3.9ng/mL、5.2ng/mL。四苯基铁卟啉与核酸以插入式和静电引力结合,在核酸表面聚集增强了RLS信号。 第三,μ-氧代双四苯基卟吩合铁RLS法测定核酸。μ-氧代双四苯基卟吩合铁中铁原子除与氮原子配位外还结合氧原子,分子具有良好的刚性平面结构。该方法灵敏度比上述单核的金属卟啉法更高。小牛胸腺DNA、鱼精DNA和酵母RNA的线性范围分别为0.02-2.5μg/mL、0.02-2.7μg/mL、0.03-3.1μg/mL,检测限分别为1.0 ng/mL、1.1 ng/mL、1.2ng/mL。 第四,两性离子表面活性剂十二烷基二甲基甜菜碱(BS-12)RLS法测定DNA。首次研究了BS-12与DNA的共振光散射光谱,发现在pH9.3的缓冲液中DNA与BS-12在388nm处有共振光散射增强,其强度与核酸的浓度呈线性关系,据此建立了一种测定核酸的共振