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《中南大学》 2004年
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人IGFBP-3cDNA的克隆、表达及对肝癌细胞的抑制作用

罗开忠  
【摘要】:研究背景与目的:作为一个重要的抗癌基因,IGFBP-3受到越来越广泛的重视。它对常见的恶性肿瘤如肺癌、前列腺癌、乳腺癌等均有明显的抑制作用。为了探讨其在肝癌发病机制中的作用,为肝癌的诊治提供新的方法,我们拟测定病毒性肝炎及肝癌患者血清IGFBP-3浓度及肝组织中IGFBP-3的表达情况。同时克隆人IGFBP-3 cDNA,构建真核表达重组载体,并研究其对肝癌细胞增殖分裂及凋亡的影响。 材料与方法:1.收集不同类型病毒性肝炎、肝硬化以及肝癌患者的血清,用酶联免疫的方法测定血清中IGFBP-3的浓度。同时,采用免疫组织化学染色的方法对病毒性肝炎及肝癌患者肝组织标本中的IGFBP-3进行测定。2.根据GenBank中人IGFBP-3 cDNA的序列,结合表达载体pcDNA3.1(+)的特点设计、合成引物。采用TRIzol? Reagent从正常人肝组织中提取总RNA。通过RT-PCR的方法扩增人成熟IGFBP-3 cDNA片段,然后将其定向克隆到载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达重组载体pcDNA3.1-BP3。并用PCR、限制性内切酶酶切以及DNA序列测定等方法进行鉴定。3.通过脂质体LipofectamineTM 2000介导的转染法将空载体pcDNA3.1(+)及pcDNA3.1-BP3转染至Hep3B细胞中,并通过G418筛选获得稳定表达细胞株。采用WesternBlot测定细胞培养上清中IGFBP-3的含量,同时用免疫组织化学染色的方法测定细胞内IGFBP-3的含量。4.应用细胞增殖实验、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)、流式细胞仪细胞周期测定等方法观察内源性IGFBP-3对肝癌细胞Hep3B的抑制作用。 结果: 1.正常对照、急性肝炎、慢性肝炎中度、慢性肝炎重度、慢性重型肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中IGFBP-3的浓度分别为4891.63±1482.91、4243.88±1086.02、3361.38±584.11、3021.63±946.48、1951.13±791.96、1146.93±443.15及1760.61±958.88(ng/ml)。病毒性肝炎患者与正常对照组比较,除急性肝炎组外,各组患者血清IGFBP-3浓度均明显降低;随着病情的加重,血清IGFBP-3浓度逐渐降低。与正常对照,急性、慢性病毒性肝炎患者比较,肝癌患者血清IGFBP-3水平显着降低,但与重型肝炎及肝硬化患者相比均没有显着性差异。血清IGFBP-3与血清白蛋白、前白蛋白呈正相关,与凝血酶原时间、总胆红素、直接胆红素呈负相关。 2.正常对照、慢性肝炎、肝硬化及肝癌组织中IGFBP-3的表达阳性率分别为100%(11/11)、100%(12/12)、87.5%(14/16)及42.86%(9/21)。采
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R735.7

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【参考文献】
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