大鼠脂肪干细胞（ADSCs）的培养、向神经细胞的分化以及BDNF基因和其受体trkB的表达

【摘要】： 目的：证实能从大鼠脂肪组织中分离出脂肪干细胞(ADSCs)，并通过体外培养观察其在形态、生长方式以及贴壁率、生长曲线等生物学特征。借鉴骨髓干细胞向神经组织细胞分化的诱导模式并进行改良，证明能够以此诱导ADSCs向神经细胞方向分化，以及得到其分化成为细胞的具体特征。在其预诱导阶段动态观察神经干细胞特异性标志Nestin的表达情况，试图阐述ADSCs的分化机制与中间过程。最后，对比ADSCs分化前后细胞的BDNF基因和BDNF的特异受体trkB的表达水平的变化。希望能够证明ADSCs是一种具有自我复制并连续传代、可分化为神经细胞并具备执行神经细胞某种功能的能力的成体干细胞。 方法：第一章从健康S—D大鼠的腹股沟和腹膜后取出脂肪组织，结合机械分离和消化法分离出ADSCs，并接种于15％FBS BMDM培基中。相差显微镜下观察其形态，并进行传代。取第三代细胞测定其贴壁率、MTT比色法描绘生长曲线，免疫荧光法鉴定干细胞标志物CD44。第二章首先通过两步诱导法诱导ADSCs向神经细胞方向分化，免疫荧光法检测分化后细胞NSE、GFAP的表达情况，以明确分化结果。再次，在分化过程中观察细胞形态学的变化，免疫组化检测Nestin的动态变化，验证ADSCs分化与神经干细胞的关系。第三章通过RT—PCR检测ADSCs分化前后BDNF基因表达的变化以及免疫组化检测其受体trkB表达水平的变化，结果用SPSS11.0统计软件进行差异性分析。 结果：从大鼠的脂肪组织中可成功提取ADSCs，其呈贴壁式生长，贴壁速度快，形态为梭状，在含血清培养中能够连续传代并稳定增殖，而且ADSCs强烈表达CD44，符合脂肪干细胞的命名。经神经祖细胞维持培养基和巯基乙醇联合诱导后，大部分ADSCs可分化表达NSE的神经元，而未见星形胶质细胞特异表面标志GFAP的表达。分化过程中Nestin表达水平经统计学分析后呈逐渐下降趋势从21.83％到9.10％，认为ADSCs的分化不经历神经干细胞的中间过程，可能是前者仅分化为神经元而不向胶质细胞分化的原因。在分化结束后，BDNF基因转录水平较分化前显著提高，而且该基因产物BDNF的酪氨酸激酶型受体trkB在蛋白水平的表达亦平行升高，说明除形态学和表型的“神经化”外，ADSCs分化成的细胞也具有了相当执行和介导神经系统细胞功能的能力。 结论：ADSCs具有强大的扩增能力和定向分化为神经元的生物学特性，分化后在形态、表型和功能三个层面上同时表现出了显著变化，可以成为治疗神经系统损伤、退行性疾病的较为理想的成体干细胞，其用途包括神经元的替代和成为外源基因或药物的携带载体等。

【关键词】：脂肪干细胞 脑源性神经营养因子 trkB受体
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R329
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