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《中南大学》 2007年
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核糖体打靶载体电转染肝细胞条件的优化

曹善仁  
【摘要】: 目前基因治疗的一个难点就是寻找一个安全,稳定,高效的基因转移系统,病毒基因转移系统和非病毒基因转移系统是两种常用的转染手段。出于安全性方面的考虑,我们实验室已经构建了核糖体基因区打靶载体(human ribosomal DNA-target ing vector)—pHrneo,它是一种人源非病毒载体,可以靶向性地整合到人核糖体基因区,并且已经成功地利用该载体将外源基因人凝血因子Ⅷ导入人纤维肉瘤细胞(HT1080)中,获得定点整合细胞克隆。但是,利用该载体转染正常细胞,其转染效率还是很低。 目的:本课题利用携带有绿色荧光蛋白基因(GFP)的核糖体基因区打靶载体(pHrneo-GFP)电转染成人肝细胞株(HL7702),优化电穿孔转染(电转染)的参数,并且将HL7702细胞同步化,提高该载体的电转染效率。 方法: 一.优化电转染参数 细胞数和电转染缓冲液体积;孵育条件;电压与电容;电转染缓冲液(介质)是影响电转染效率的几个主要参数。我们设计了多组独立实验以优化上面这些参数。电转染细胞后,通过台盼蓝染色得到转染后细胞活率;流式细胞仪分析转染48小时后基因表达效率。优化电转染参数,得到一个最适合核糖体打靶载体转染成人肝细胞株(HL7702)的电转染条件。 二.细胞同步化对电转染的影响 考虑到处于G2/M期的细胞会有利于电转染,选择羟基脲(hydroxyurea)作为HL7702的细胞同步化药物,利用它将HL7702细胞同步在G2/M期,再对同步化处理细胞和阴性对照细胞同时进行电转染,分析细胞同步在G2/M期对电转染的影响。 结果:优化四组电转染参数后,可以得到92.53±2.31%的转染后细胞活率和26.03±2.40%的GFP基因表达率。羟基脲可以将60%以上的HL7702细胞同步在G2/M期,并且得到了90%以上的转染后活率和60%以上的转染后基因表达率。 结论:本课题通过对一系列电转染条件的优化,稳定得到了一个90%以上活率,60%以上外源基因表达率的电转染方法,为核糖体基因区打靶载体更好地在基因治疗中的应用提供了帮助。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q78

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