收藏本站
《中南大学》 2007年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

HSR对烧伤血清诱导的巨噬细胞TNF-α、HMGB1和IL-10基因表达调控及其分子机制

尹朝奇  
【摘要】: 第一章烧伤血清诱导的巨噬细胞系RAW264.7释放TNF-α、HMGB1及lL-10的规律及意义 目的:从细胞水平探讨烧伤血清处理的RAW264.7细胞释放炎症介质TNF-α、HMGBl、IL-10的规律及意义。 方法:制备严重烧伤大鼠模型获取烧伤大鼠血清;采用小鼠RAW264.7巨噬细胞,分别以烧伤大鼠血清处理制备细胞模型;细胞随机分为两组:(1)正常血清处理组(2)烧伤血清处理组。两组的剂量效应分别用含有体积分数0%、5%、10%、20%的正常血清及烧伤血清的培养基与RAW264.7细胞系共培养24h,分别收取烧伤血清刺激组及对照组细胞培养上清,3500g离心后留取上清于-20℃保存备用。两组的时间效应分别以含有体积分数20%的正常血清及烧伤血清培养基分别培养RAW264.7细胞0h,4h,12h,24h,同上留取离心后的培养液上清。以上每组均设3个复孔,用双抗体夹心ELISA法测定RAW264.7培养上清中TNF-α和IL-10含量,Western blot分析RAW264.7细胞HMGBl的含量。 结果:实验发现,正常培养的小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞经不同体积分数的正常血清处理24h后TNF-α分泌量极低,而经不同体积分数的烧伤血清分别处理24h后RAW264.7细胞能分泌大量的TNF-α,(0.06±0.02ng/ml),(0.14±0.03ng/ml),(0.16±0.04 ng/ml),(0.21±0.02ng/ml)(P<0.05);Western blot检测发现,发现①正常RAW264.7巨噬细胞中有少量HMGBl表达;②应用正常SD大鼠血清干预RAW264.7细胞,发现HMGBl的表达量与正常RAW264.7巨噬细胞HMGBl表达量无显著差异,无统计学意义(P>0.05);③应用烧伤血清干预的RAW264.7巨噬细胞,其HMGBl的表达量至18小时达到高峰,至24小时仍维持高水平表达。烧伤血清诱导RAW264.7的IL-10分泌量与烧伤血清浓度无显著的剂量依赖性关系,经ELISA法测定,无烧伤血清对照组RAW264.7细胞IL-10分泌量极低,烧伤血清组在培养24h后RAW264.7分泌IL-10量逐渐升高。 结论:烧伤血清能以时间和剂量依赖方式诱导小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的TNF-α的分泌增加,以时间依赖方式诱导HMGBl和IL-10的分泌增加。 第二章热休克反应对烧伤大鼠的保护作用及对烧伤血清诱导的巨噬细胞TNF—a,IL—10及HMGBl的影响 目的:探讨HSR对烧伤大鼠的保护作用及对烧伤血清诱导的TNF-α、IL-10和HMGBl的影响。 方法:制备烧伤大鼠模型,观察72h内死亡率;伤后6h取各组动物血清观测各项血清学指标,一部分大鼠于HSR(42℃,15min,室温下恢复24h)后再进行烧伤,24h后摘取肝、肺组织行病理切片检查。将传代RAW264.7细胞随机分为三组:(1)正常血清处理组。(2)烧伤血清处理组。(3)热休克预处理后烧伤血清处理组:热休克(HSR)处理:将细胞置于42℃的水浴箱中热休克1h,然后在37℃恢复12h,然后加入烧伤血清处理。三组的剂量效应分别用含有体积分数0%、5%、10%、20%的正常血清及烧伤血清的培养基与小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7共培养24h,分别收取烧伤血清刺激组及对照组细胞培养上清,3500g离心后留取上清备用。三组的时间效应分别以含有体积分数20%的正常血清及烧伤血清的培养基分别培养RAW264.7细胞0h,4h,12h,24h,同上留取离心后的培养液上清,以上每组均设3个复孔。用双抗体夹心ELISA法测定RAW264.7培养上清中TNF-α和IL-10含量,Western blot分析HMGBl的含量,RT-PCR检测TNF-αmRNA的表达、IL-10mRNA的表达。 结果:大鼠严重烧伤后72h存活率为40%,较对照组明显下降(P<0.05);HSR组大鼠烧伤后存活率为60%,较单纯烧伤组明显上升(P<0.05);大鼠严重烧伤后6h血清中细胞因子TNF-α水平较伤前明显升高,IL-10水平稍增高,HSR后与烧伤组比较,IL-10水平升高,TNF-α水平下降,显示HSR明显抑制大鼠严重烧伤后血清中TNF-α水平,并上调IL-10水平。细胞在经热休克预处理后能抑制烧伤血清诱导的HMGBl释放,热休克预处理后(热休克后恢复1h)再给予烧伤血清刺激,TNF-αmRNA水平表达逐渐降低,细胞经热休克预处理后上调IL-10mRNA的表达。 结论:HSR抑制烧伤血清诱导的RAW264.7细胞HMGBl释放和TNF-αmRNA的表达;HSR上调烧伤血清诱导的RAW264.7细胞IL-10mRNA的表达。 第三章HSFI过表达对RAW264.7巨噬细胞TNF-a,IL-10及HMGBl基因表达的影响 目的:探讨热休克因子1(heat shock factorl,HSFl)过表达对烧伤血清处理的巨噬细胞炎症介质TNF-α、高迁移率族蛋白-1(HMGBl)、IL-10基因表达的影响。 方法:制备严重烧伤大鼠模型,获取烧伤大鼠血清;构建HSFl基因的真核表达载体,继而将HSF1真核表达载体转染RAW264.7巨噬细胞,建立稳定转染HSFl的巨噬细胞株,最后将转基因细胞经烧伤血清处理,探讨HSFl过表达对烧伤血清处理的RAW264.7巨噬细胞TNF-a,HMGBl和IL-10基因表达的影响。 结果:建立了稳定表达HSFl的RAW264.7细胞株,在该细胞株中有HSFl的部分活化;RT-PCR检测发现,正常血清处理的RAW264.7巨噬细胞中没有发现TNF-αmRNA和HMGBl mRNA的表达,而烧伤血清刺激能明显诱导TNF-αmRNA和HMGBl mRNA表达;与转空载体相比,HSFl过表达可明显抑制烧伤血清处理的RAW264.7巨噬细胞中TNF-αmRNA和HMGBl mRNA的表达;正常情况下IL-10 mRNA在RAW264.7巨噬细胞中有少量表达,而烧伤血清处理能诱导IL-10 mRNA表达增加;与转空载体相比,HSFl过表达对烧伤血清处理的RAW264.7巨噬细胞IL-10 mRNA的表达具有上调作用。 结论:HSFl过表达可以抑制烧伤血清诱导的RAW264.7巨噬细胞TNF-a mRNA和HMGBlmRNA的表达,同时上调IL-10 mRNA的表达。 第四章HSFl对IL-10的转录调控研究 目的:探讨HSFl对IL-10的转录调控机制。 方法:合成IL-10基因启动子区含HSE位点的寡核苷酸探针进行凝胶滞留实验(EMSA),分析HSFl与IL-10基因启动子区的HSE的结合情况,并构建IL-10基因启动子的萤光素酶报告基因质粒,与HSFl表达质粒共转染RAW264.7细胞,检测萤光素酶活性,观察HSFl转染对启动子活性的影响。 结果:生物素标记的HSFl结合片段(-376bp~-369bp)和核蛋白提取物孵育后能观察到阻滞带,阻滞现象能够被自身非标记探针竞争,但不被非标记的突变探针竞争,加入HSFl单克隆抗体,可以观测到超阻滞带,表明HSFl可以特异性结合于“HSFl识别序列”,HSE核心结合位点突变后,相对萤光素酶活性突变体(34.23±2.14)相对野生型(110.09±5.48)下降3.2倍,P值<0.01,通过EMSA证实了IL-10启动子区域(-688bp~+64bp)存在HSFl的结合位点HSE(-376bp~-369bp);突变体双萤光素酶活性分析发现HSFl的结合位点核心碱基的突变,其转录活性下降。结论-HSFl可以特异性结合于IL-10启动子区HSE(-376bp~-369bp),相对萤光素酶活性分析提示HSFl可以转录激活IL-10,上调其表达。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R644

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陈广文;王慷慨;刘瑛;唐道林;肖献忠;;HSF1基因剔除对HSR抗内毒素血症的影响[J];生物化学与生物物理进展;2008年04期
2 朱新裘,曹兆丰,刘发益,邬力祥,周晓燕;热休克反应对培养的大鼠脑星形胶质细胞的保护作用及对其IL-6分泌的影响[J];生理学报;1998年03期
3 王慷慨,蒋磊,易宇欣,刘可,鄂顺梅,唐道林,王建设,石永忠,王秋鹏,肖献忠;热休克反应对氧化应激所致nucleolin裂解的影响[J];中南大学学报(医学版);2004年05期
4 张顺利,郭玫,张新胜,李效阳,徐存拴;热休克对小鼠心、肝、肾磷酸酶活性的影响[J];上海实验动物科学;1998年02期
5 徐存拴,周爽,李三强;麻醉对小鼠热休克反应的影响[J];解剖学报;2003年02期
6 肖卫民,鄂顺梅,刘瑛,张华莉,肖献忠;热休克因子1调控的细胞凋亡相关基因的筛选与鉴定[J];中国动脉硬化杂志;2004年01期
7 罗炳德,王斌,邹飞,陈光忠,万为人,郭进强;热休克反应对大鼠中暑休克的影响及意义[J];中国工业医学杂志;2004年02期
8 张顺利,魏纪东,陈晓虹,张文学,张新胜,徐存拴;小鼠不同组织器官热休克蛋白70表达的研究[J];解剖学报;2002年04期
9 张蕴莉,刘锦,丛俏,任铁力,许德顺;热休克反应对TNF-α诱导凋亡作用影响的研究[J];中国实验诊断学;2002年05期
10 王斌,罗炳德,邹飞,刘瑶;热休克反应对高温诱导的低血压的保护作用及其机制[J];中国应用生理学杂志;2004年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王韵;张宗梁;;热休克反应通过JNK信号通路抑制小鼠腹腔巨噬细胞中IL-18的表达[A];中国细胞生物学学会第八届会员代表大会暨学术大会论文摘要集[C];2003年
2 杨守京;刘彦仿;叶玲;赵君;赵荣;胡锡祺;李明升;晏培松;;流行性出血热诱导热休克反应及其在病毒感染和发病过程中的作用和意义[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展(下册)[C];1999年
3 杨守京;刘彦仿;叶玲;赵荣;孙玉静;赵君;;肾综合征出血热诱导热休克反应及其与病毒感染关系和意义的研究进展[A];西部大开发 科教先行与可持续发展——中国科协2000年学术年会文集[C];2000年
4 徐存拴;李三强;周爽;;麻醉对大鼠应激反应的影响[A];中国细胞生物学学会医学细胞生物学、免疫细胞生物学和发育生物学专业委员会学术研讨会论文摘要汇编[C];2002年
5 王斌;罗炳德;邹飞;陈光忠;万为人;郭进强;;热休克反应对高温诱导的脑损害的保护作用[A];中国生理学会第六届应用生理学委员会全国学术会议论文摘要汇编[C];2003年
6 龚俊松;景亮;;谷氨酰胺——热休克反应诱导剂[A];第十五次长江流域麻醉学学术年会暨2010年中南六省麻醉学学术年会暨2010年湖北省麻醉学学术年会论文集[C];2010年
7 张顺利;郭玫;张文学;张新胜;李效阳;李立;徐存拴;;热休克反应中小白鼠肾脏HSP70表达和乳酸脱氢酶同工酶变化的初步研究[A];中国动物科学研究——中国动物学会第十四届会员代表大会及中国动物学会65周年年会论文集[C];1999年
8 王斌;罗炳德;邹飞;万为人;郭进强;陈雪梅;;热休克反应对热暴露大鼠的保护作用及其心肌丙二醛含量的影响[A];中国生理学会第六届应用生理学委员会全国学术会议论文摘要汇编[C];2003年
9 陈裕充;温海;徐红;李志刚;仇芸;;热休克反应对新生隐球菌于二性霉素B MIC值的影响(英文)[A];2002中国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2002年
10 王学敏;徐晓辉;郭兴中;缪明永;;热休克反应时糖皮质激素受体mRNA减少机理的探讨[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 尹朝奇;HSR对烧伤血清诱导的巨噬细胞TNF-α、HMGB1和IL-10基因表达调控及其分子机制[D];中南大学;2007年
2 王韵;热休克反应对小鼠巨噬细胞IL-18基因表达调节的研究[D];第三军医大学;2003年
3 李江伟;hsp90基因热诱导激活通路的初探[D];中国协和医科大学;2000年
4 黄煌;热休克蛋白90基因的诱导表达及其α基因上游片段转录活性的探讨[D];中国协和医科大学;1994年
5 刘瑛;KLF4:一个热休克反应和热休克蛋白表达的新调控介质[D];中南大学;2006年
6 陆腾;复杂体系的计算机模拟[D];中国科学技术大学;2008年
7 王立新;通腑醒神液直肠滴注对出血中风神昏及热休克反应的影响[D];广州中医药大学;2002年
8 孙东旭;肝脏枯否细胞在感染诱发多器官损伤中的作用[D];中国协和医科大学;1999年
9 肖卫民;热休克蛋白对过氧化氢所致心肌细胞凋亡的影响及其机制研究[D];中南大学;2003年
10 王锐;磁流体热疗结合HSR1反义寡核苷酸抑制人脑膜瘤增殖和诱导细胞凋亡的体外实验研究[D];福建医科大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈裕充;热休克反应在新生隐球菌致病中的作用[D];第二军医大学;2001年
2 余璐;汉坦病毒体外诱导HSP70表达的定量研究[D];第四军医大学;2005年
3 于军;热休克时SMMC-7721细胞糖皮质激素受体mRNA减少机理初探[D];第二军医大学;2006年
4 徐晓辉;热休克反应时糖皮质激素受体mRNA减少机理的探讨[D];第二军医大学;2001年
5 杨吉伟;热休克因子-1和多药耐药基因-1在肾癌中的表达及其意义[D];武汉大学;2004年
6 海珊;热休克条件下诱导型HSP70对人胚肺二倍体细胞衰老的影响[D];四川大学;2005年
7 唐志鹏;大鼠C_6胶质瘤细胞进行阿霉素化疗后热休克因子1和P-糖蛋白表达关系的研究[D];中国医科大学;2006年
8 董正伟;热休克的细胞遗传毒性研究[D];浙江大学;2007年
9 刘瑛;从HSF1基因敲除小鼠心肌中筛选及克隆热休克反应中受HSF1调控的靶基因[D];中南大学;2003年
10 张然;LPS致家兔发热过程中下丘脑HSF1和HSP70的表达与cAMP和PGE_2含量的变化[D];中国医科大学;2005年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026