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《中南大学》 2007年
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Na~+/H~+交换蛋白1抑制剂抗糖基化终末产物所致内皮损伤的作用及机制研究

宋涛  
【摘要】: 第一章Cariporide对糖基化终末产物(AGEs)损伤大鼠离体血管内皮功能的保护作用 目的:观察选择性钠氢交换抑制剂Cariporide对糖基化牛血清白蛋白(AGEs-BSA)损伤离体大鼠胸主动脉内皮功能的保护作用。 方法:离体大鼠胸主动脉血管环经AGEs-BSA(200μg/ml)孵育120 min后,检测乙酰胆碱引起的内皮依赖性舒张反应和硝普钠所致的非内皮依赖性舒张反应。用分光光度法测定血管组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及一氧化氮(NO)含量。 结果:①AGEs-BSA导致了乙酰胆碱引起的胸主动脉内皮依赖性舒张反应降低,对硝普钠引起的非内皮依赖性舒张反应无影响;②AGEs-BSA在损伤大鼠胸主动脉内皮功能的同时,增加了血管组织中MDA的含量、降低了SOD活性和NO含量;③Cariporide(0.01,0.1,1μM)明显减轻了AGEs-BSA对大鼠离体胸主动脉内皮依赖性舒张功能的损伤,并能抑制AGEs-BSA所致的血管组织中MDA浓度的升高,能抑制AGEs-BSA所致的SOD活性及NO的浓度的降低;④单纯BSA对乙酰胆碱引起的大鼠胸主动脉内皮依赖性舒张反应无影响。 结论:Cariporide对AGEs-BSA所致的血管内皮功能损伤有保护作用。AGEs-BSA诱导血管内皮功能紊乱可能与NHE-1活化及氧化应激增加有关。 第二章Cariporide对AGEs所致在体大鼠血管内皮功能损伤的保护作用 目的:观察Cariporide对AGEs在体损伤大鼠血管内皮功能的保护作用。 方法:采用尾静脉射AGEs-BSA的方法诱导大鼠血管功能损伤,用Cariporide(0.1,1 mg/kg/d)进行治疗。治疗4周后处死动物,取主动脉弓做组织形态学检查及NF-κB-p65的免疫组化检测,胸主动脉用于血管舒张功能的检测,并测定血清NO及MDA含量。 结果:①大鼠注射外源性AGEs-BSA后,主动脉对乙酰胆碱引起的内皮依赖性舒张明显反应降低,但对硝普钠引起的非内皮依赖性舒张反应无明显影响,大鼠MDA水平增加,血清NO水平降低;②Cariporide呈剂量依赖性地改善外源性AGEs-BSA所致大鼠胸主动脉内皮依赖性舒张反应,抑制AGEs-BSA引起的血清MDA浓度升高和血清NO的降低;③各组大鼠组织形态学检查未发现明显异常,但给予外源性AGEs-BSA后大鼠血管内皮NF-κB活性明显增加,同时给予Cariporide治疗显著抑制了AGEs对内皮细胞中NF-κB的活化。 结论:Cariporide对AGEs诱导的大鼠血管内皮功能损伤具有保护作用。其保护作用可能与降低氧化应激、抑制血管内皮细胞的NF-κB活化有关。 第三章AGEs对NHE-1活性的影响及作用机制 目的:在培养的人血管内皮细胞模型上观察AGEs对NHE-1活性和基因表达的影响,以及NHE-1的活化与氧化应激的关系,探讨Cariporide抗AGEs所致内皮功能损伤的机制。 方法:①用AGEs-BSA与HUVECs孵育不同时间(0、1、3、6、12h),观察AGEs-BSA对NHE-1影响的时效关系;②用不同浓度AGEs-BSA(10、50、100μg/ml)与HUVECs共同孵育,观察AGEs-BSA对NHE-1影响的量效关系以及预先加入不同抑制剂(PKC抑制剂、RAGE抗体、NADPH氧化酶抑制剂)对AGEs-BSA作用的影响;③用不同浓度的Cariporide(0.1、1、10μM)或不同抑制剂(PKC抑制剂、NADPH氧化酶抑制剂)与AGEs-BSA(100μg/ml)共孵育HUVECs,观察HUVECs中[Ca~(2+)]_i及ROS的变化;④用AGEs-BSA与HUVECs孵育不同时间(0、3、6、12、24 h),观察AGEs-BSA对NHE-1 mRNA表达的影响。NHE-1的活性、细胞内pH值、Ca~(2+)浓度和ROS的生成用荧光分光光度法检测,NHE-1mRNA的表达逆转录聚合酶链式反应用检测。 结果:①AGEs-BSA(10、50、100μg/ml)呈时间和浓度依赖性增高NHE-1的活性和pH_i,RAGE抗体、PKC抑制剂GF-109203X(10μg/ml)能有效阻断AGEs-BSA对NHE-1的活化,NADPH氧化酶抑制剂Apocynine(100μM)对AGEs-BSA引起的NHE-1活化无影响;②Cariporide(0.1、1、10μM)能浓度依赖性降低AGEs-BSA引起的[Ca~(2+)]_i升高和ROS的生成,PKC抑制剂GF-109203X(10μg/ml)能有效阻断AGEs-BSA引起的[Ca~(2+)]_i升高和ROS的生成、NADPH氧化酶抑制剂Apocynine(100μM)对AGEs-BSA引起的[Ca~(2+)]_i升高无影响,但能显著减少ROS的生成;③AGEs-BSA分别与HUVECs孵育3、6、12、24 h后,对NHE-1 mRNA表达无明显影响。 结论:①AGEs-BSA能上调人血管内皮细胞NHE-1的活性,可能由PKC所介导。②AGEs-BSA诱导内皮细胞产生的氧化应激作用可能与NHE-1的活性增加有关。 第四章Cariporide对AGEs诱导的NF-κB活化及其下游效应分子的影响 目的:观察Cariporide对AGEs诱导的人血管内皮细胞NF-κB活化及其调控的下游其效应分子表达的影响。 方法:①用免疫荧光染色法观察AGEs引起的内皮细胞NF-κB-p65亚基的核转位的时效情况,并观察Cariporide(10μM)或不同抑制剂(NF-κB抑制剂、PKC抑制剂、NADPH氧化酶抑制剂)对AGEs引起的内皮细胞NF-κB-p65亚基核转位的影响;②用Western-blot方法与NF-κB-p65同步检测IκB-α蛋白水平;③采用双抗体夹心ELISA法检测AGEs对内皮细胞上清液TNF-α和sICAM-1水平影响的时效关系,并观察Cariporide(0.1、1、10μM)或不同抑制剂(NF-κB抑制剂、PKC抑制剂、NADPH氧化酶抑制剂)干预后的作用。 结果:①AGEs-BSA(100μg/ml)呈时间依赖性增加内皮细胞NF-κB活化即核转位,并呈时间依赖性降低细胞中IκB-α蛋白的水平。Cariporide能明显抑制AGEs-BSA引起的NF-κB核转位和IκB-α蛋白的降解,预先加入NF-κB抑制剂PDTC(100μM)、PKC抑制剂GF-109203X(10μg/ml)和NADPH氧化酶抑制剂Apocynine(100μM)均能明显抑制AGEs-BSA引起的NF-κB活化和减少IκB-α蛋白的降解;②AGEs-BSA(100μg/ml)作用6、12、24、48 h后能显著升高HUVECs上清液中的TNF-α和sICAM-1的浓度,并呈时间依赖性。Cariporide能明显抑制AGEs-BSA诱导的TNF-α和sICAM-1的生成,预先加入NF-κB抑制剂组PDTC、PKC抑制剂GF-109203X以及NADPH氧化酶抑制剂Apocynine均能显著抑制AGEs-BSA诱导的TNF-α和sICAM-1的生成。 结论:AGEs-BSA引起的内皮细胞NF-κB活化与其诱发的氧化应激有关,Cariporide可能抑制通过抑制AGEs-BSA引起的氧化应激而降低NF-κB的活化及其效应分子的表达。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R96

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