脂肪间充质干细胞纤维蛋白胶复合物修复成年兔骨软骨缺损的研究

【摘要】： 第一部分 兔脂肪间充质干细胞的分离、培养、鉴定及体外向软骨细胞分化的诱导 目的：探索成年兔脂肪间充质干细胞分离和培养的方法，研究其增殖和体外向软骨细胞诱导分化的能力。 方法：自成年兔颈后取脂肪组织，采用Ⅰ型胶原酶消化分离法获取细胞。用含10％新生牛血清的DMEM培养基培养细胞，并进行传代，倒置显微镜观察细胞形态。MTT法测定第4、8代细胞的增殖能力。软骨诱导剂在体外诱导第5代细胞向软骨细胞分化，倒置显微镜观察细胞生长情况。并于诱导1周后，对细胞进行番红O染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色，RT-PCR法测定细胞Ⅱ型胶原mRNA的表达。 结果：原代细胞培养2～3天后开始贴壁生长，逐渐伸展为梭形或多角细胞，约7～9天后细胞几乎完全融合，细胞呈旋涡状排列。传代后的细胞第二天就可全部伸展为梭形或多角形，第4～6天后可生长到几乎完全融合。8代之内的细胞形态未见明显改变。第4代细胞倍增时间为31.5±2.7h，第8代细胞为33.9±6.0h，之间无显著性差异(p＞0.05)。诱导后第2～3天细胞开始逐渐发生聚集。聚集的高密度细胞团块番红O染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色均为阳性，未发生聚集的细胞则呈弱阳性或阴性。RT-PCR测定显示诱导1周后的细胞表达Ⅱ型胶原mRNA，未诱导的细胞不表达Ⅱ型胶原mRNA。 结论：从成年兔脂肪组织中分离培养出的脂肪间充质干细胞，具有很强的增殖和自我更新能力，并具有向软骨细胞分化的潜能。脂肪间充质干细胞可以作为软骨组织工程种子细胞的选择之一。 第二部分纤维蛋白胶与兔脂肪间充质干细胞生物相容性的研究 目的：研究纤维蛋白胶与兔脂肪间充质干细胞的生物相容性，探讨其作为组织工程支架承载脂肪间充质干细胞的可行性。 方法：将第4代兔脂肪间充质干细胞以5×10~3／孔，接种于96孔板中的纤维蛋白胶中(A组)、纤维蛋白胶表面(B组)和培养板表面(C组)。通过MTT法绘制各组细胞的生长曲线，并计算细胞倍增时间。倒置显微镜和扫描电镜观察细胞在培养板表面，纤维蛋白胶表面和内部的形态及生长情况。 结果：在纤维蛋白胶表面和96孔板表面生长的细胞形态以梭形为主，B组和C组的细胞接种后经过3天左右的滞留期，进入对数生长期，第7～8天逐渐发生融合，B组和C组的细胞倍增时间分别为33.3±6.1h和31.5±2.7h，两组之间没有显著性差异(p=0.419＞0.05)。在纤维蛋白胶内部立体生长的细胞伸展及增殖速度缓慢，细胞形态以星形和类球形为主，A组细胞接种后经过约8～9天的慢速生长期，才进入快速增长期，到第13～14天后再次进入慢速生长期，A组的细胞倍增时间为39.7±10.6h，与C组之间有显著性差异(p=0.03＜0.05)。 结论：纤维蛋白胶与兔脂肪间充质干细胞之间具有良好的生物相容性。当脂肪间充质干细胞在纤维蛋白胶中立体生长时增殖速度缓慢。 第三部分脂肪间充质干细胞纤维蛋白胶复合物修复骨骼成熟兔骨软骨缺损 目的：探讨脂肪间充质干细胞纤维蛋白胶复合物在骨骼成熟兔体内环境下诱导成软骨，修复骨软骨损伤的可行性。 方法：在32只骨骼发育成熟的中国白兔膝关节股骨滑车中央制作直径为4mm，深约为4～5mm的骨软骨缺损。在骨软骨缺损中分别植入脂肪间充质干细胞纤维蛋白胶复合物(脂肪间充质干细胞纤维蛋白胶复合物修复组)、无细胞的纤维蛋白胶(单纯纤维蛋白胶修复组)或不做处理(自发修复组)。术后6周和12周分批处死实验动物，观察骨软骨缺损修复的情况。 结果：术后6周，脂肪间充质干细胞纤维蛋白胶复合物修复组以透明软骨样组织修复缺损，大体评分9.6±0.8分，组织学评分1.4±0.5分；单纯纤维蛋白胶修复组缺损区仍为缺损，大体评分4.7±0.5分，组织学评分14.0±0.0分；自发修复组主要由纤维组织修复，大体评分7.4±1.3分，组织学评分8.4±2.0分。术后12周，脂肪间充质干细胞纤维蛋白胶复合物修复组以透明软骨样组织修复缺损，透明软骨样组织较6周时成熟，大体评分9.7±0.5分，组织学评分0.7±0.8分；单纯纤维蛋白胶修复组缺损区仍未得到良好填充，大体评分4.0±0.0分，组织学评分14.0±0.0分；自发修复组主要由纤维组织修复，大体评分8.5±0.8分，组织学评分8.8±0.9分。术后6、12周脂肪间充质干细胞纤维蛋白胶复合物修复组大体评分和组织学平分，优于单纯纤维蛋白胶修复组和自发修复组，分别比较均有显著性差异(P＜0.05)。 结论：脂肪间充质干细胞纤维蛋白胶复合物体在骨骼成熟兔体内环境下可以诱导形成透明软骨样组织，修复直径为4mm的非负重区骨软骨缺损。

【关键词】：脂肪 干细胞 分离 培养 软骨分化 脂肪 干细胞 纤维蛋白胶 生物相容性 兔 脂肪 干细胞 纤维蛋白胶 骨软骨缺损 骨骼成熟兔
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R687
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