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《中南大学》 2007年
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糖尿病肾病肾小管上皮细胞表型转化及罗格列酮对其干预作用的实验研究

肖湘成  
【摘要】: 糖尿病肾病肾小管上皮细胞表型转化及罗格列酮对其干预作用的实验研究 目的:本课题拟通过高糖刺激人类近端肾小管上皮细胞(HK-2)生长和实验性糖尿病肾病大鼠模型,用罗格列酮分别进行干预实验,观察肾小管上皮细胞形态、增殖状况及肾小管上皮细胞表型转化(EMT)相关标志蛋白表达情况。通过体内、外两部分实验进一步揭示高糖这一病理因素在肾小管上皮细胞表型转化过程中的作用和PPAR-γ激动剂治疗糖尿病肾病的分子机制,为探讨糖尿病肾病的发病机制及糖尿病肾病的早期治疗提供新的线索及理论依据。 方法:第一部分细胞实验:采用HK-2细胞第3代细胞株,同步培养后分为5组:N组为正常对照组(含5.5mmol/L葡萄糖),H组为高糖组(含25mmol/L葡萄糖),M组为高渗对照组(含5.5mmol/L葡萄糖及19.5mmol/L甘露醇),HR5组为高糖DMEM加低浓度罗格列酮组(H组加入5μmol/LRGZ),HR10组为高糖DMEM加高浓度罗格列酮组(H组加入10μmol/L RGZ)。采用MTT法测定HK-2细胞增殖;光镜和电镜分别观察HK-2细胞的基本结构与超微结构;RT-PCR法和Western blot法分别检测HK-2细胞FSPl、α-SMA、E-cad的mRNA和蛋白表达;收集细胞上清液体用ELISA法检测TGF-β1的浓度。 第二部分动物实验:选择清洁级Wistar雄性大鼠18只,随机分为3组:N组为正常大鼠对照组(n=6),D组为糖尿病肾病大鼠模型组(n=6),R组为糖尿病肾病大鼠罗格列酮(文迪雅)干预组(n=6)。采用双缩脲法测定24小时尿蛋白定量;硝基酚比色法测定尿NAG酶活性;全自动生化分析仪检测Scr及24小时Ucr。取肾组织切片后行HE和MASSON染色;免疫组化法检测FSP1、α-SMA、ColⅠ、CK-18表达;RT-PCR法检测FSPl、α-SMA、CK-18的mRNA表达。 结果:第一部分细胞实验:①与N组比较,H组HK-2细胞呈梭形变,电镜下粗面内质网明显增加,线粒体及微绒毛明显减少,细胞内出现肌微丝样结构;FSPl、a-SMA mRNA和蛋白表达增强(P<0.01),E-cadmRNA和蛋白表达减弱(P<0.01);细胞上清液TGFβl浓度升高(P<0.01)。②与H组比较,RGZ干预组HK-2细胞恢复为多边形或圆形,电镜下微绒毛增多,线粒体数目增加,粗面内质网减少;FSPl、a-SMA mRNA和蛋白表达下降(P<0.05或0.01),E-cadmRNA和蛋白表达增加(P<0.01);细胞上清液TGFβl浓度下降(P<0.05或0.01)。高浓度RGZ组较低浓度组FSPl、a-SMA、E-cad的mRNA和蛋白表达变化更显著(P<0.01),TGFβl浓度下降更明显(P<0.01)。③与N组比较,H组HK-2细胞增殖更为明显,24hr、48hr、72hr三个时间点,细胞增殖数量分别是N组的1.19倍、1.31倍、1.51倍(P<0.05或0.01)。与H组比较,RGZ干预后HK-2细胞增殖受到抑制(P<0.05或0.01),48hr、72hr时间点高浓度RGZ组抑制细胞增殖能力较低浓度组更显著(P<0.05)。 第二部分动物实验:①与N组比较,D组大鼠尿pro增多、尿NAG酶升高、Scr增高、Ccr下降(P<0.01);肾组织肾小管变性、间质纤维化病变明显;FSPl,a-SMA蛋白和mRNA表达水平上调(P<0.01),CK-18蛋白和mRNA表达水平下调(P<0.01),ColⅠ蛋白表达增加(P<0.01)。②与D组比较,R组尿pro减少、尿NAG酶下降、Scr降低、Ccr升高(P<0.01);肾组织肾小管变性、间质纤维化病变减轻;FSPl,a-SMA蛋白和mRNA表达下调(P<0.05或0.01),CK-18蛋白和mRNA表达上调(P<0.05),ColⅠ蛋白表达降低(P<0.05)。 结论:①高糖刺激后的HK-2细胞和糖尿病肾病大鼠均出现肾小管细胞向肌成纤维细胞的表型转化,提示糖尿病肾病时存在EMT现象。②糖尿病肾病大鼠血尿生化指标和ColⅠ表达的变化,提示肾小管上皮细胞表型转化在促进肾纤维化的发生、发展方面起了重要作用。③罗格列酮能够逆转高糖刺激的HK-2细胞和糖尿病肾病大鼠肾小管细胞的表型转化,减轻肾脏纤维化进程,有效地保护肾功能。④高糖状态下,HK-2细胞转分化的发生可能与TGFβl的表达上调有关;罗格列酮可能通过抑制TGFβl来阻抑EMT进程。
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