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《中南大学》 2007年
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肝靶向乙型肝炎免疫球蛋白纳米药物的实验研究

彭忠田  
【摘要】: 背景乙型肝炎(Hepatitis B,HB)是世界上最常见的传染病之一。全世界估计约20亿人曾感染过乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV),其中超过4.0亿人为慢性HBV感染者。尽管乙肝疫苗已广泛用于预防,且效果明显,但仍有数百万人未得到保护而感染了HBV。至今,慢性乙型肝炎的治疗仍缺乏能治愈的特异、高效的方法,抗病毒治疗是慢性乙肝综合治疗中的主要措施,但目前可用于临床的抗病毒治疗还未能达到疗效令人满意的程度。因而积极寻求、开发新的治疗病毒性乙型肝炎的药物,是当今亟待解决的重点课题之一。乙型肝炎免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin,HBIG)是针对HBV的特异性被动免疫制剂,早期研究认为其治疗作用是对血循环中包含HBsAg颗粒的高亲和力结合及对HBV的中和作用。最近研究报道HBIG体外细胞实验中能减少HBV的分泌或干扰包含HBV DNA中间体的核衣壳的包封,并可预防移植肝免受HBV再感染。因而推测HBIG可能成为新的有效的慢性乙型肝炎的抗病毒治疗药物。 纳米粒(nanoparticles,NP)是一类由天然或合成的高分子材料制成的粒径在1nm~1000nm的固态胶体颗粒,在体内易被巨噬细胞吞噬而集中分布在网状内皮系统丰富的肝、脾等部位,以纳米粒作为载体制成的纳米粒给药系统具有靶向性、改变药物体内分布、控缓释药及提高药物生物利用度等诸多优点。因此开展肝靶向给药系统的研究,对于以肝脏为主要病变部位的疾病的治疗是一重要研究方向。 目的基于HBIG的药理作用与纳米粒给药系统的显著优点,选择氰基丙烯酸正丁酯(butyl cyanoacylate,BCA)为载体材料,探索乳化聚合法在较高pH值条件下制备肝靶向乙型肝炎免疫球蛋白聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒[poly(butylcynaoacrylate) nanoparticles of hepatitis B immunoglobul in,HBIG-PBCA-NP]的工艺,研究肝靶向HBIG-PBCA-NP的肝靶向性与生物安全性,比较HBIG与HBIG-PBCA-NP对肝细胞的跨膜转运作用和对HBV感染细胞模型培养上清HBsAg、HBV DNA分泌抑制作用的差异变化,进一步探讨肝靶向给药系统在乙型病毒性肝炎抗病毒治疗中的应用价值,为乙型肝炎的抗病毒治疗提供新的思路和开辟新的途径。 方法 1、HBIG抑制HBsAg、HBV DNA分泌的体外实验研究:以含不同浓度HBIG的培养基培养QSG7701细胞,在不同的时间点取培养上清定量检测的HBsAb,以透过率评价HBIG的体外跨膜转运作用;以HepG2.2.15细胞为HBV感染细胞模型,在培养基中加入不同浓度的HBIG共培养数天,或先以一定浓度的HBIG共培养,第3天后更换为不含HBIG的培养基继续培养至第11天,分别于不同时间点收集培养上清定量检测HBsAg、HBV DNA;定量检测HBsAg和HBsAb采用时间分辨免疫荧光分析法(time-resolved immunofluorometric assay,IFMA)、HBV DNA采用实时荧光定量PCR法(real time fluorogenic quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR);用MTT法观察药物的细胞毒性。 2、肝靶向HBIG-PBCA-NP的制备工艺研究:选择BCA为载体材料,用乳化聚合法在较高pH值条件下制备HBIG-PBCA-NP,以HBIG-PBCA-NP的包封率、纳米粒的外观形态、多分散度、粒径及其分布作为评价指标,采用多种单因素试验作初选,均匀设计和正交试验设计作精选的方法,优选出制备HBIG-PBCA-NP的最佳制备工艺。 3、肝靶向HBIG-PBCA-NP的肝靶向性研究:HBIG-PBCA-NP与HepG2.2.15细胞及QSG7701细胞共孵育,透射电镜观察细胞内的纳米粒;以含不同浓度HBIG-PBCA-NP的培养基培养QSG7701细胞,选择不同的时间点定量检测培养上清的HBsAb,以透过率评价HBIG-PBCA-NP对肝细胞的通透性;以HBIG-PBCA-NP和/或HBIG尾静脉注射昆明小鼠,透射电镜观察肝细胞内的纳米粒,免疫组织化学检测肝组织HBIG的含量;采用Iodogen固相法制备~(125)I-HBIG;用优选的HBIG-PBCA-NP制备工艺制备~(125)I-HBIG纳米粒(~(125)I-HBIG-PBCA-NP);尾静脉注射~(125)I-HBIG-PBCA-NP和~(125)I-HBIG后,在不同的时间点比较小鼠各组织和每克组织中的~(125)I放射性强度占总放射性强度的百分率,计算靶向指数,评价~(125)I-HBIG-PBCA-NP在各组织器官中的分布。 4、肝靶向HBIG-PBCA-NP的生物安全性研究:HBIG-PBCA-NP与HepG 2.2.15细胞及QSG7701细胞共孵育,光镜及透射电镜观察细胞的病理变化;以HepG2.2.15细胞、QSG7701细胞及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)为细胞模型,用MTT法检测细胞相对抑制率研究不同浓度的HBIG-PBCA-NP、HBIG和空白纳米粒的细胞毒性,自动生化仪检测QSG7701细胞培养上清液LDH、ALT活性;以HBIG-PBCA-NP和/或HBIG尾静脉注射昆明小鼠,透射电镜、HE染色观察观察肝细胞的病理变化,自动生化仪检测血清ALT变化;体外试管法研究HBIG-PBCA-NP的溶血试验。 5、肝靶向HBIG-PBCA-NP抑制HBsAg、HBV DNA分泌的体外实验研究:与HBIG抑制HBsAg、HBV DNA分泌的体外实验研究方法相同。 结果 1、HBIG浓度为0.1、0.2、0.4IU/ml与QSG7701细胞共孵育48h时,肝细胞内约有38%~46%的HBIG。HBIG浓度为0.1IU/ml~10.0IU/ml作用于第3、6、9天时能抑制HepG2.2.15细胞培养上清HBsAg、HBV DNA的分泌,浓度为0.01IU/ml时无此作用。在无药物继续培养的第5、7天,培养上清HBsAg浓度较有药物培养的第3天继续下降,随后(第9、11天)浓度逐步增高,到第11天时,与对照组比较,差异无显著性;培养上清HBV DNA水平在第5天时,较第3天继续下降,第7、9、11天时逐步增高,与对照组比较,差异无显著性。 2、优选出乳化聚合法制备肝靶向HBIG-PBCA-NP的制备工艺,按优化工艺制备的HBIG-PBCA-NP,形态圆整、分散性好、光滑不粘连,多分散度较小,其平均粒径为(119.87±8.01)nm,粒径主要分布在50~220nm,药物包封率(90.10±3.66)%。 3、在HepG2.2.15细胞和QSG7701细胞的透射电镜照片中胞浆和细胞核内可见纳米粒;不同浓度的HBIG-PBCA-NP与QSG7701细胞共孵育48h时,肝细胞内约有65%~73%的HBIG,约是相同浓度HBIG的1.5倍;昆明种小鼠肝组织透射电镜照片中可见大量的纳米粒;肝组织HBIG免疫组化结果表明相同浓度的HBIG-PBCA-NP组比HBIG组显色更明显;~(125)I-HBIG产品放射性浓度为1.82mci/7ml,放射比活度为152.25μci/mg HBIG;制备~(125)I-HBIG-PBCA-NP的平均粒径为(123.85±7.61)nm,包封率为(86.3±5.1)%。~(125)I-HBIG和~(125)I-HBIG-PBCA-NP尾静脉注射小鼠各组织的放射性强度比较:在不同时间点~(125)I-HBIG-PBCA-NP在肝脏的放射性强度(CPM%)增加且放射性驻留时间更长;HBIG纳米粒组中每克肝组织的放射性强度百分率(CPM%/g)的分布最高,其次是脾脏;~(125)I-HBIG-PBCA-NP在肝脏、脾脏的靶向指数DTI均大于1,且肝脏大于脾脏。 4、光镜及透射电镜下HepG2.2.15细胞及QSG7701细胞无明显病理改变;在所研究的浓度范围内,HBIG、HBIG纳米粒及空白纳米粒对QSG7701细胞、HepG2.2.15细胞、PBMC的细胞毒性分级为0~1级,即无细胞毒性;各组不同浓度QSG7701细胞培养上清LDH、ALT值无统计学差异;各浓度组HBIG、HBIG纳米粒及空白纳米粒的实验小鼠的肝组织电镜照片及HE染色无明显病理改变;各组血清ALT与对照组无差异;HBIG-PBCA-NP无溶血性。 5、HBIG-PBCA-NP浓度为0.1IU/ml~10.0IU/ml作用于第3、6、9天时能抑制HepG2.2.15细胞培养上清HBsAg、HBV DNA的分泌,与对照组比较,差异有显著性。但与相同浓度HBIG组比较无显著性差异。在无药物继续培养的第5、7天,培养上清HBsAg浓度较有药物培养的第3天继续下降,随后(第9、11天)逐步增高,第5~11天时与对照组比较,第9~11天时与同浓度HBIG组比较,差异有显著性;培养上清HBV DNA水平第5天时,较第3天继续下降,第7、9、11天时逐步增高,第7天时0.1、1.0、5.0IU/ml的纳米粒组与对照组及同浓度的HBIG组比较,第9天时1.0、5.0IU/ml的纳米粒组与同浓度的HBIG组比较,第11天时5.0IU/ml的纳米粒组与同浓度的HBIG组比较,差异有显著性。 结论 1、在体外细胞实验中,HBIG能跨膜转运入肝细胞内,且HBIG能抑制HBsAg、HBV DNA的分泌。 2、在pH5.2条件下优选出肝靶向HBIG纳米粒的制备工艺,经HBIG纳米粒大小、形态、包封率等指标考察,该工艺条件可作为肝靶向HBIG纳米粒的最佳制备工艺。 3、肝靶向HBIG纳米粒具有良好的肝靶向缓释性和生物安全性。 4、在体外细胞实验中,HBIG-PBCA-NP能跨膜转运入肝细胞内,HBIG纳米粒能抑制HBsAg、HBV DNA的分泌,且较纳米化前的HBIG作用有增强趋势,并具有缓释特性。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R512.62

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