组织工程化周围神经修复大鼠坐骨神经损伤的实验研究

【摘要】： 第一章大鼠去细胞组织工程化神经支架的制备及形态学研究 目的：采取化学处理方法，去除大鼠周围神经中的细胞和髓鞘以取得去细胞的组织工程化神经支架。 方法：10只SD大鼠，共20条坐骨神经分为2组，每组10条。分别为正常神经对照组和化学去细胞实验组。然后在光镜和电镜下对各组神经组织行组织学结构观察，通过免疫组织化学分析其成分。 结果：去细胞神经呈淡乳白色圆柱状外观，略透亮，其延展性较化学处理前略增加。经脱细胞处理后，去除了Schwann细胞、神经纤维的髓鞘和轴突，保存了由Schwann细胞基底膜管以及神经外膜和束膜的细胞外基质构成的三维支架结构。 结论：化学处理所获得的去细胞神经在组织结构和成分上已经达到了相应的要求，能否成为有效的神经移植修复材料，仍需要进一步的实验研究加以验证。 第二章大鼠脂肪干细胞的培养及向类Sehwann细胞的诱导分化 目的：掌握大鼠脂肪干细胞的分离、培养和扩增的方法，并探讨其生物学特性及向类Schwann细胞方向分化的条件。 方法：无菌技术下切取近交系大鼠双侧腹股沟脂肪垫，加入适量Ⅰ型胶原酶消化获取脂肪干细胞，接种入含10％新生牛血清的DMEM培养液，倒置显微镜下连续观察细胞形态变化。取传代细胞用流式细胞仪检测表面抗原标志CD_(29)、CD_(34)、CD_(44)；四唑盐比色试验(MTT法)测定第1、4、10代细胞的生长曲线；原代细胞传代至第4代，进行诱导培养，在倒置显微镜下观察脂肪干细胞生长情况、诱导前后的形态学变化，S-100、GFAP免疫细胞化学染色并计算其阳性率和染色灰度值。 结果：原代培养显示原代细胞3天左右开始贴壁，呈梭形成纤维样细胞形态，8d左右可达90％融合，呈旋涡状排列，形成集落。传代后2～4h开始贴壁，经过较短的潜伏期后开始增殖，3d即可长满。10代以后细胞传代后潜伏期延长，细胞增殖速度逐渐减慢。流式细胞仪检测结果有95％的细胞表达CD_(44)，96％的细胞表达CD_(29)，而只有5％的细胞表达CD_(34)。生长曲线显示第1、4代大鼠脂肪干细胞增殖能力较强，以第4代细胞为甚，第10代细胞增殖能力减弱。依次加入诱导剂后部分细胞向Schwann细胞形态转变，免疫细胞化学染色S-100、GFAP呈阳性表达。诱导至第4d时细胞染色阳性率及灰度值优于诱导2d，8d组。 结论：1．从大鼠脂肪组织中可以有效地分离、培养具有间充质干细胞的特性的脂肪干细胞。2．脂肪干细胞可以在体外经诱导分化为类Schwann细胞。 第三章经诱导分化的大鼠脂肪干细胞用于构建组织工程化周围神经的实验研究 目的：应用去细胞神经支架及诱导分化的脂肪干细胞构成组织工程化周围神经，了解两者相容性，以及组织工程化周围神经修复大鼠坐骨神经缺损的实验效果，为临床研究提供资料。 方法：按照前述方法培养并诱导近交系大鼠脂肪干细胞向类Sehwann分化，将诱导分化的脂肪干细胞悬液注入已制备的去细胞同种异体神经支架管中，倒置显微镜观察细胞生长情况；扫描电镜下观察细胞在材料上附着情况；四唑盐比色试验(MTT法)测定细胞活性；取两组近交系大鼠，分别用组织工程化神经和自体神经桥接10mm神经缺损，通过大体观察、坐骨神经功能指数恢复率(SFI％)的测定、神经电生理(NEP)的测定、组织学光镜观察、透射电镜观察、再生有髓神经纤维计数恢复率、神经纤维直径恢复率、髓鞘厚度恢复率的测定等指标评价实验效果。 结果：1w后扫描电镜下可见接种的类Schwann细胞分散在材料表面的孔隙内，细胞形态为星状，细胞突起与支架管壁粘附；MTT法测定细胞活性示神经支架组在各时间点与对照组无显著性差异P＞0.05)；12w时两组动物坐骨神经外观、组织学光镜观察、透射电镜观察结果相似、两组坐骨神经功能指数恢复率(SFI％)、神经电生理(NEP)、再生有髓神经纤维计数恢复率、神经纤维直径恢复率、髓鞘厚度恢复率等指标相比无显著性差异(P＞0.05)。 结论：1．去细胞同种异体神经与类Schwann细胞的组织相容性好，未见明显排异反应。2．两者构建的组织工程化神经能有效地修复大鼠坐骨神经缺损，其效果与自体神经移植无显著差异。

【关键词】：去细胞神经 坐骨神经 神经移植 脂肪干细胞 类Schwann细胞 诱导分化 组织工程 脂肪干细胞 类Schwann细胞 去细胞神经 神经再生
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R651.3
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