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人脂肪间充质干细胞与PHBV构建组织工程化软骨的研究

叶川  
【摘要】: 第一章脂肪间充质干细胞的分离、培养及体外诱导成软骨细胞能力的研究 目的探讨人脂肪间充质干细胞的分离、培养方法,研究其生物学特征及诱导分化成软骨细胞的能力。 方法取吸脂术后废弃脂肪,酶消化法获取细胞,于含10%新生牛血清的低糖DMEM培养基中进行原代及传代培养。流式细胞术检测第6代细胞表面抗原CD29和CD44的表达情况。对第6代细胞进行成软骨细胞诱导,诱导培养基为高糖DMEM,含1%新生牛血清、10μg/L TGF-β1、6.25mg/L转铁蛋白、1×10~(-7)mol/L地塞米松和50mg/L维生素C。观察脂肪间充质干细胞的生长情况、形态变化。于诱导14天时应用阿尔新兰染色、甲苯胺兰染色、番红0染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色、Aggrecan免疫荧光染色了解其分化成软骨细胞的能力。逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)检测脂肪间充质干细胞诱导0天、14天时Ⅱ型前胶原的基因表达情况。蛋白印迹试验(Western-blot)检测脂肪间充质干细胞诱导0天、14天时Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan蛋白的表达情况。 结果原代培养后24小时少量圆形及多角形细胞开始贴壁生长,48-72小时贴壁细胞数量增多并以短梭形和多角形为主,5天时细胞形态呈长梭形,10-12天细胞融合达90-100%。传代细胞贴壁时间较原代细胞缩短,6小时80%细胞完成贴壁,6天左右细胞单层融合。传3代后细胞形态均呈长梭形。10代以后细胞出现椭圆形、短梭形样变,停止生长并逐渐脱壁。流式细胞术检测第6代细胞有91%表达CD44,98%表达CD29。在诱导培养基作用下,脂肪间充质干细胞生长增殖减慢,形态由长梭型渐变为三角形、多角形,14天时部分细胞聚集成软骨细胞特有的铺路石样改变。诱导培养基作用下14天时阿尔新兰、甲苯胺兰、番红0、Ⅱ型胶原蛋白免疫组化、Aggrecan免疫荧光等染色均呈阳性。RT-PCR检测0天时前Ⅱ型胶原基因呈阴性表达,14天时呈阳性表达。Western-blot检测在脂肪间充质干细胞诱导后0天时Ⅱ型胶原、Aggrecan的蛋白为阴性表达,14天时为阳性表达。 结论可从吸脂术来源的脂肪组织中分离培养出脂肪间充质干细胞,其具有较强的增殖能力,可为组织工程提供大量表型稳定的种子细胞,符合组织工程种子细胞的基本条件。在以TGF为主要诱导成分的培养基作用下人脂肪间充质干细胞可以向软骨细胞分化。 第二章脂肪间充质干细胞与PHBV体外生物相容性及诱导成软骨的研究 目的观察脂肪间充质干细胞在PHBV多空泡沫材料上生长并在软骨诱导培养基作用下向软骨细胞分化的能力,以及PHBV作为软骨组织工程支架材料体外生物相容性等方面的性能研究。 方法将PHBV灭菌后予左旋多聚赖氨酸修饰。取第6代人脂肪间充质干细胞以2×10~7/L的密度接种在PHBV支架材料上,分诱导组和未诱导组。诱导组在诱导培养基(诱导成分同实验一)作用下进行成软骨诱导,未诱导组在含10%新生牛血清的高糖DMEM下培养。丫啶橙染色及扫描电镜观察细胞在材料上生长情况,石蜡包埋切片后行HE染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、Aggrecan免疫荧光染色,观察脂肪间充质干细胞在PHBV材料内部的生长情况和成软骨能力。RT-PCR检测脂肪间充质干细胞/PHBV复合培养2周时未诱导组和诱导组前Ⅱ型胶原的mRNA的表达情况。 结果经多聚赖氨酸修饰后的PHBV表现出良好的亲水性和细胞吸附性。诱导组丫啶橙染色见细胞生长旺盛;扫描电镜见基质分泌较多,未诱导组基质分泌较少;HE染色可见细胞于PHBV内生长,但未见明显软骨陷窝形成;Ⅱ型胶原蛋白免疫组化、Aggrecan免疫荧光均呈阳性。未诱导组以上检测呈阴性。2周时RT-PCR检测诱导组前Ⅱ型胶原mRNA呈阳表达,未诱导组呈阴性表达。 结论PHBV对脂肪间充质干细胞有良好的体外生物相容性,复合培养时在软骨诱导培养基作用下细胞可在PHBV内生长并在诱导后向软骨细胞分化,分泌软骨细胞特异性基质。 第三章人脂肪间充质干细胞复合PHBV体内异位成软骨能力的研究 目的探讨人脂肪间充质干细胞/PHBV复合物体外成软骨诱导后植入裸鼠体内异位构建组织工程化软骨的能力。 方法将实验二中的诱导组和未诱导组细胞/支架复合物体外培养2周后植入裸鼠背部皮下,观察裸鼠皮下种植的细胞/支架复合物形态变化。分别于8周和12周取材行HE染色、番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、Aggrecan免疫荧光染色观察脂肪间充质干细胞/PHBV复合物的异位成软骨能力。蛋白印迹试验(Western-blot)检测复合物诱导组8周、12周和未诱导组12周的Ⅱ型胶原和Aggrecan的蛋白表达。 结果裸鼠生存状态良好,诱导组细胞/支架复合物的大小形态基本保持原状,质地变韧;未诱导组细胞/支架复合在8周取材时体积缩小,支架部分残留,12周时完全降解。8周和12周时诱导组甲苯胺兰染色、番红O染色、Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色、Aggrecan免疫荧光染色检测均呈阳性,复合物边缘见到少量软骨陷窝,但有材料残留。Western-blot检测诱导组8周、12周的Ⅱ型胶原和软骨蛋白聚糖Aggrecan的蛋白表达呈阳性,未诱导组12周两项指标均呈阴性。 结论人脂肪间充质干细胞复合PHBV材料经体外诱导后初步具有在裸鼠体内异位构建组织工程化软骨的能力,但PHBV的降解需要进一步调控。


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