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《中南大学》 2008年
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离体人真皮成纤维细胞热损伤变性后转归及HSP90的保护作用

李德全  
【摘要】: 目的探讨体外培养的成纤维细胞(Fibroblast FB)热损伤变性后形态,功能的变化规律及HSP90的表达。方法采用体外组织细胞培养技术培养离体人真皮成纤维细胞,选择52℃浴水加热30S作为实验组,37℃30S为对照组,于3h,6h,12h,24h,36h,48h,72h,96h,120h,168h,240h等不同时相点分别采用MTT法,倒置显微镜,透射电镜,流式细胞仪,反向高效液相仪,乳酸脱氢酶(Lactic Acid Dehydrogenase,LDH)试剂盒,Na~+-K~+-ATP酶试剂盒,Ⅰ型胶原和碱性成纤维细胞生长因子(FGF_2)ELASA Kit,RT-PCR,免疫荧光及Western blot等技术对上述两组细胞的存活,形态,细胞膜通透性,Na~+-K~+-ATP酶,FGF_2的分泌,Ⅰ型胶原的转录,分泌及HSP90的合成等进行检测。结果实验组成纤维细胞生存率为50%,显著低于对照组(P<0.05),电镜显示实验组细胞3h细胞膜,线粒体,内质网有明显损伤,透明样物,髓鞘样物增多,24h达到顶峰,细胞核形态始终未见明显异常,72h(3天)后成纤维细胞开始逐渐恢复,168h(7天)细胞形态基本恢复正常。流式细胞仪提示细胞滞留S期(S为21.13%),明显高于对照组(S为14.29%,P<0.01);实验组细胞凋亡率(3.59%)也明显高于对照组(0.12%)(P<0.01)。实验组细胞3h细胞膜LDH漏出率为1057.90±243.61U/L,显著高于对照组646.08±248.98 U/L(P<0.05),24hLDH漏出率达到高峰(实验组:1493.88±80.723 U/L,对照组:62150±228.82 U/L,P<0.01),72h后基本恢复正常。实验组胞膜中3h Na~+—K~+—ATP酶的活性为1.40±0.04 U/L,低于对照组1.49±0.04U/L(P<0.05,为正常活性的95.3‰),24h实验组Na~+-K~+-ATP酶的活性为0.30±0.02 U/L,低于对照组0.49±0.06 U/L(P<0.05,为正常活性的61.2‰),48h后基本恢复正常。实验组3h细胞线粒体ATP量为345439.4±33954.24μg/ml,低于对照组435416.4±23613.27μg/ml(实验组ATP量为对照组的79‰,P<0.05),24h实验组细胞线粒体ATP量进一步降低为94731.00±1082.12μg/ml,明显低于对照组215604.2±20610.17μg/ml(实验组ATP量为对照组的43.94‰,P<0.05)。实验组24h,168h,240h的细胞外FGF_2量与对照组无差异(P>0.05),48h,72h,96h,120h比对照组低(P<0.05)且它们之间相对稳定(P>0.05).24h,72h,120h,168h,240h实验组细胞Ⅰ型胶原的转录,分泌与对照组无差别(P>0.05)。用免疫荧光观察到FB热损伤后24h胞浆,胞核中HSP90高表达。Western blot显示3h即有HSP90表达量升高,24h达到高峰,维持到96h以上,120h恢复到正常。结论FB热损伤变性后形态改变,代谢障碍,功能降低,其功能于48h-120h(2-5天)逐渐恢复,7天基本恢复正常的形态,功能,HSP90对FB热损伤变性具有保护作用。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R622;R329.2

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
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