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《中南大学》 2008年
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脓毒症大鼠调节性T细胞凋亡对效应T细胞免疫功能的影响及血必净注射液的干预作用

戴新贵  
【摘要】: 目的:1:探讨脓毒症CD4~+CD25~+Treg凋亡对CD4~+效应T细胞免疫功能的影响及血必净注射液的干预作用。 方法:1)体外实验:断颈处死Wister大鼠,无菌取脾脏,分离单个核细胞。1:免疫磁珠法(MACS)分离正常大鼠脾脏CD4~+T细胞、CD4~+CD25~-T细胞、及CD4~+CD25~+Treg,以异硫氰酸荧光素(FITC)标记CD25,流式细胞术(FCM)鉴定细胞纯度,0.4%台盼蓝染色检测细胞存活率。2:将体外分离的CD4~+CD25~+Treg分为对照组、抗-CD3/CD28刺激组、抗-CD3/CD28+脂多糖(LPS)刺激组、抗-CD3/CD28+LPS+血必净组(5mg/ml)、抗-CD3/CD28+血必净组,于第3天以别藻蓝蛋白(APC)标记Annexin-V及放线菌素D(7-AAD)标记Treg,FCM检测细胞的凋亡率;藻红蛋白荧光素(PE)标记表面标志物叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)和T淋巴细胞毒性相关抗原4(CTLA-4),FCM检测Foxp3和CTLA-4平均荧光强度;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-10分泌情况。3:将各组Treg分别与CD4~+CD25T细胞1:1共培养,刀豆素(ConA)刺激68h,噻唑蓝(MTT)比色分析法检测T细胞增殖、ELISA法检测白介素2(IL-2)和可溶性IL-2受体(sIL-2R)及辅助性T细胞(Th)漂移因子干扰素γ(INFγ)/IL-4/IL-17的分泌。2)体内实验:复制盲肠结扎并穿孔(CLP)大鼠脓毒症模型,体外提取脾脏CD4~+CD25~+Treg培养过夜。1:将大鼠分为对照组、假手术组、CLP组,血必净组(4mg/kg),于第3天检测FOXP3、CTLA-4、凋亡率、IL-10。2:将各组CD4~+CD25~+Treg与CD4~+CD25~-T细胞1:1共培养,ConA刺激68h,检测T细胞增殖、IL-2/sIL-2R、INFγ/IL-4/IL-17。 结果:1)体外实验:1:Treg凋亡:对照组凋亡率各时间点之间比较无统计学意义(P>0.05);抗-CD3/CD28单克隆抗体诱导Treg凋亡率明显高于同时间对照组(P<0.01),达25-40%。Foxp3、CTLA-4与凋亡率呈负相关;抗-CD3/CD28+LPS刺激组凋亡率高于同时间对照组(P<0.01),稍低于抗-CD3/CD28刺激组,但无统计学意义(P>0.05),而Foxp3、CTLA-4与对照组比较并不随凋亡率增加而降低。2:对效应T细胞免疫功能的影响:①T细胞增殖:正常Treg能明显抑制Teff增殖功能,抗-CD3/CD28组和anti-CD3/CD28+血必净组明显高于对照组(P<0.05),抗-CD3/CD28+LPS较对照组明显降低(P<0.05),抗-CD3/CD28+LPS+血必净组与抗-CD3/CD28+LPS组比较有明显差异(P<0.01)。②IL-2/sIL-2Ra的分泌:IL-2:抗-CD3/CD28刺激组较对照组明显升高(P<0.01);抗-CD3/CD28+LPS刺激组明显低于对照组和抗-CD3/CD28刺激组(P<0.01);抗-CD3/CD28+LPS+血必净刺激组较对照组、抗-CD3/CD28刺激组、抗-CD3/CD28+血必净刺激组明显降低(P<0.05或P<0.01),而较抗-CD3/CD28+LPS组升高(P<0.01)。sIL-2Ra:抗-CD3/CD28+LPS组较抗-CD3/CD28组有明显升高,抗-CD3/CD28+LPS+血必净组较抗-CD3/28+血必净组有明显升高。③Th1/Th2/Th17(IFNγ/IL-4/IL-17)漂移:INFγ和IL-4随凋亡增加而升高,抗-CD3/CD28+LPS+血必净组INFγ分泌明显高于抗-CD3/CD28+LPS组(P<0.05),而IL-4则呈相反变化(P<0.05),使IFNγ/IL-4升高P<0.05);抗-CD3/CD28+血必净组IL-17较抗-CD3/CD28组有明显降低(P<0.05)。2)体内实验:1:Treg凋亡:结果表明对照组Treg凋亡率为12.03±0.89%,假手术组(9.48±2.17%)和对照组比较无明显差异,CLP组凋亡率(5.87±0.44%)低于对照组(P<0.05),而血必净治疗组明显高于其他各组(P<0.01)。Foxp3、CTLA-4表达和IL-10分泌功能随凋亡率增加而减少,成负相关。2:对效应T细胞免疫功能的影响:①T细胞增殖:MTT检测Teff增殖显示CLP组抑制率明显高于对照组(P<0.01),而血必净组抑制率低于CLP组和对照组(P<0.01)。②IL-2/sIL-2Ra的分泌:CLP组IL-2分泌低于对照组(P<0.05),sIL-2Ra高于对照组(P<0.05);血必净组IL-2分泌高于CLP组(P<0.05),sIL-2Ra低于CLP组(P<0.01)。③Th1/Th2/Th17(IFNγ/IL-4/IL-17)漂移:CLP组INFγ、IL-4和IFNγ/IL-4与对照组比较有明显升高(P<0.05);而血必净治疗组IFNγ、IL-4、IFNγ/IL-4明显高于CLP组(P<0.05);各组IL-17无明显变化。 结论:1:抗-CD3/CD28能有效诱导脓毒症Treg凋亡,Treg凋亡后细胞接触机制和分泌功能下降。2:脓毒症Treg对效应T细胞具有强力免疫抑制功能,血必净注射液促进Treg凋亡后可有效改善其对效应T细胞的细胞免疫抑制作用。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R459.7;R285.5

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