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《中南大学》 2007年
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Twist基因对胃癌细胞侵袭和转移的影响及其机制的研究

罗庚求  
【摘要】: 前言:胃癌是一种严重危害人们生命健康的常见肿瘤,它的发病机制尚不清楚。Twist蛋白是属于碱性的螺旋-环-螺旋蛋白家族中的高度保守的转录因子,在胚胎的发生发展中发挥重要作用。Twist被认为是癌基因蛋白,影响肿瘤细胞的凋亡。Twist作为上皮-间质转型(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程中的关键调控因子,对肿瘤的侵袭和转移有重要影响。尽管目前已积累了一些有关Twist的研究,但是Twist对胃癌细胞侵袭和转移有何影响却知之较少。 目的:研究Twist基因转染对胃癌细胞侵袭和转移的影响,探讨Twist在胃癌发生、发展中的作用及其机制。 方法:通过细菌转化、质粒提取、酶切、凝胶电泳、基因测序鉴定Twist正义质粒;利用脂质体介导转染技术转染SGC7901胃癌细胞株,经G418筛选得到稳定高表达Twist的TwistS-SGC7901(PcDNA3-Twist转染的SGC7901细胞)细胞模型;采用RT-PCR方法检测三组细胞中Twist的mRNA水平;采用免疫荧光和和Western blot分析法检测三组细胞中Twist的表达;经RT-PCR分析Twist转染对EMT标记物(Ecadherin,α-SMA)表达的影响;采用MTT比色法测定转染细胞的黏附能力,Boyden小室测定法测定转染细胞的迁移能力和侵袭能力;腹腔移植法建立裸鼠胃癌细胞转移模型。采用免疫荧光检测三组细胞中β-catenin的表达及定位;用EMSA方法检测Tcf-4/Lef的DNA结合活性;用RT-PCR分析Tcf-4下游靶基因cyclinD1的表达;用Western blot分析Tcf-4下游靶基因vimentin、mmp-2的表达。用ELISA方法分析Tcf-4下游靶基因VEGF的表达。 通过细菌转化、提取Twist反义质粒;利用脂质体介导转染技术转染MKN45胃癌细胞株,经G418筛选得到稳定低表达Twist的TwistAS-MKN45(PcDNA3-TwistAS转染的MKN45细胞)细胞模型;采用RT-PCR方法检测三组细胞中Twist的mRNA水平;采用Western blot分析法检测三组细胞中Twist的表达。用EMSA方法检测Tcf-4/Lef的DNA结合活性;用RT-PCR分析Tcf-4下游靶基因cyclinD1的表达;Western blot分析Tcf-4下游靶基因vimentin和mmp-2的表达。用ELISA方法分析Tcf-4下游靶基因VEGF的表达。用Western-blot分析了E-cadherin的表达。 利用免疫组织化学方法分析了Twist和Ecadherin在76例胃癌中的表达水平及其和临床病理参数之间的关系。 结果:成功建立了Twist稳定高表达的细胞模型(TwistS-SGC7901);与SGC7901细胞及PcDNA3-SGC7901细胞相比较,TwistS-SGC7901细胞的黏附能力、迁移能力、侵袭能力和转移能力明显提高(p<0.05);Twist能够促进SGC7901细胞发生EMT;Twist正义质粒转染能够增强SGC7901细胞TCF-4转录因子的DNA结合活性;并且能够提高TCF-4转录因子下游靶基因cyclinD1、VEGF、vimentin和mmp-2的表达。 成功建立了Twist稳定低表达的细胞模型(TwistAS-MKN45);Twist反义质粒转染能够降低MKN45细胞TCF-4转录因子的DNA结合活性;并且能够降低TCF-4转录因子下游靶基因cyclinD1、VEGF、vimentin和mmp-2的表达。 Twist蛋白阳性信号定位于细胞质及细胞核;Twist蛋白在胃癌组织中的阳性表达率为60.52%,远癌断端胃粘膜的表达阴性,且与胃癌分化程度、浸润范围以及淋巴结转移有关(P<0.05),但是和年龄、性别无关。Ecadherin蛋白在胃癌组织中的阳性表达率为47.37%,低于远癌断端胃粘膜的表达水平(100%),Ecadherin蛋白的表达与胃癌的分化程度、浸润深度和淋巴结转移密切相关(P<0.05),与年龄、性别无关。Twist蛋白的表达与Ecadherin蛋白呈负相关。 结论: 1.Twist基因高表达能够增强SGC7901细胞的黏附能力、迁移能力、侵袭能力和转移能力。 2.Twist基因能促进SGC7901细胞EMT。 3.Twist基因促进SGC7901细胞的侵袭和转移可能通过正调控Wnt信号通路而发挥作用。 4.Twist、E-cadherin在胃癌组织中的表达和胃癌的分化程度、浸润深度以及淋巴结转移有关。Twist可能通过抑制Ecadherin的表达促进胃癌的转移。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R735.2

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