丹皮酚联合氟尿嘧啶抗人不同肝癌细胞系作用及其机制研究

【摘要】： 目的:根据国内外近年对抑癌基因PTEN的研究成果,进一步研究人正常肝细胞系及7种人肝癌细胞系细胞PTEN及AKT的表达情况;并从中医药传统理论出发,观察丹皮酚联合氟尿嘧啶在体外对常见人三种肝癌细胞系增殖抑制作用,采用现代分子生物学方法,探讨其可能的分子机理。 方法:第一部分:(1)体外细胞培养:常规培养正常人肝细胞系L-02,人肝癌细胞Bel-7402,BEL-7404,BEl-7405,SMMC-7721,HepG2,MHCC97-H,MHCC97-L,并计算各细胞系倍增时间及绘制其生长曲线。(2)应用RT-PCR技术检测8种细胞系细胞PTENmRNA、Akt1,Akt2mRAN表达;Western Blot技术检测8种细胞系PTEN蛋白,p-AKT蛋白表达。第二部分:(1)应用MTT法检测Pae、5-FU单用及合用对肝癌细胞系BEL-7404,SMMC-7721,MHCC97-H增殖抑制作用,并计算其各自不同时间点的IC_(50)值。(2)应用中效原理,分别计算Pae联合5-FU抑制BEL-7404,SMMC-7721,MHCC97-H细胞系增殖的各自IC_(50)值中Pae、5-FU分别所占的浓度;同时观察两药不同给药时间、次序对各细胞系的不同效应;通过中效方程,分别计算Pae联合5-FU对各细胞系各个不同效应时的联合指数,并绘制效应-联合指数曲线;根据曲线推算Pae联合5-FU对各细胞系在各个效应时是协同、相加还是拮抗作用。(3)采用DNA ladder、TUNEL法分别检测Pae、5-FU单用及合用(各自的IC_(50)浓度,下同)诱导BEL-7404,SMMC-7721,MHCC97-H细胞凋亡。(4)RT-PCR法检测Pae、5-FU单用及合用分别对BEL-7404,SMMC-7721,MHCC97-H细胞系抑癌基因PTEN,致癌基因Akt1,Akt2mRNA表达水平的影响。(6)应用免疫细胞化学法、免疫印迹(Western Blot)法检测Pae、5-FU单用及合用分别对BEL-7404,SMMC-7721,MHCC97-H细胞系PTEN、p-AKT蛋白表达的影响。 结果:第一部分:(1)RT-PCR检测显示PTENmRNA、Akt1,Akt2mRNA在各细胞系均有表达,L-02细胞系PTENmRNA表达最强,Akt1、Akt2 mRNA表达最弱,与各肝癌细胞系比较差异有显著性;各肝癌细胞系PTENmRNA、Akt1,Akt2 mRNA表达无明显差异。(2)Western Blot检测各细胞系PTEN、p-AKT蛋白示:L-02细胞系PTEN蛋白表达最强,p-AKT表达最弱,与各肝癌细胞系比较差异有显著性;肝癌细胞系HepG2无PTEN蛋白表达,其他肝癌细胞系PTEN、p-AKT蛋白均有不同程度的表达,差异无统计学意义。第二部分:(1)MTT法检测显示Pae、5-FU单用及合用均能抑制BEL-7404,SMMC-7721,MHCC97-H细胞的增殖,其72h时IC_(50)值分别为Pae(20.77、19.19、19.47mg·L~(-1));5-FU(12.60、12.93、13.57mg·L~(-1)),且呈剂量依赖效应关系和时间依赖效应关系,呈显著正相关。(2)利用中效原理计算示,Pae联合5-FU处理BEL-7404,SMMC-7721,MHCC97-H细胞系72h,其IC_(50)分别为6.91 mg·L~(-1)(Pae:6.45;5-FU:2.26)、9.12 mg·L~(-1)(Pae:6.49,5-FU2.63)、11.46mg·L~(-1)(Pae:6.44,5-FU 5.02)。两药合用时大剂量(大于中效浓度)为拮抗作用,小剂量(小于中效浓度)时有协同作用;且效应大小与给药时间及给药顺序有关。(3)用Pae、5-FU单用及合用处理BEL-7404,SMMC-7721,MHCC97-H细胞后光镜下可见明显的凋亡细胞;DNA凝胶电泳显示出典型的凋亡特征;TUNEL法检测示凋亡细胞数随处理时间延长而增多。(4)RT-PCR检测示Pae、5-Fu单用或合用均可使BEL-7404,SMMC-7721,MHCC97-H细胞PTENmRNA表达上调,Akt1,Akt2mRNA表达下调,与对照组比差异有显著性(P＜0.01),两药合用组效果优于单药组,同时间点与单药组比,差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)。并随处理时间的延长PTENmRNA表达增强;Akt1,Akt2mRNA表达减弱。PTENmRNA与Akt1,Akt2mRNA的表达呈显著负相关(P＜0.001)。(5)免疫细胞化学、Western Blot法检测示两药单用及合用均可使BEL-7404,SMMC-7721,MHCC97-H细胞PTEN蛋白表达上调,p-AKT表达下调,与对照组比差异有显著性(P＜0.01),合用组效果优于单药组,同时间点与单药组比,差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)。并且随处理时间的延长,PTEN蛋白表达逐渐增加,p-AKT蛋白表达逐渐减弱。相关分析显示PTEN蛋白表达与p-AKT蛋白表达呈显著负相关(P＜0.001)。 结论 1.人正常肝细胞系及各肝癌细胞系抑癌基因PTENmRNA、PTEN蛋白(HepG2细胞系除外),致癌基因Akt1mRNA、Akt2mRNA,p-AKT蛋白都有不同程度的表达;各细胞系PTEN表达与AKT表达呈负相关。 2.肝癌细胞的凋亡可能与PI_3K/AKT信号转导通路有关。 3.Pae和5-FU单用或合用都能显著抑制肝癌细胞系BEL-7404、SMMC7721、MHCC97-H的增殖,诱导各细胞系凋亡。Pae联合5-FU用药大剂量时(大于中效浓度)为拮抗作用,小剂量(小于中效浓度)时有协同作用;且效应大小与给药时间及给药顺序有关。 4.Pae能够上调肝癌细胞系PTEN的表达,下调AKT的表达,这可能是其抑制肝癌细胞系增殖、诱导细胞凋亡的机制之一。