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《中南大学》 2008年
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褪黑素对视网膜母细胞瘤HXO-RB_(44)细胞成瘤性的影响

杨一涛  
【摘要】: 目的 (1)探讨褪黑素对视网膜母细胞瘤HXO-RB_(44)细胞增殖活性的影响及相关机制。 (2)探讨褪黑素对HXO-RB_(44)细胞上清液诱导的ARPE-19细胞内VEGF表达的影响及相关机制。 (3)探讨褪黑素对视网膜母细胞瘤HXO-RB_(44)细胞周期异常及细胞凋亡的影响及相关机制。 (4)探讨褪黑素对HXO-RB_(44)细胞皮下移植瘤的生长抑制作用及其相关机制。 方法 (1)利用细胞计数、MTT比色法,观察体外培养条件下,不同浓度的MLT对视网膜母细胞瘤增殖活性的影响;利用流式细胞仪测定浓度为10~(-5)M的MLT干预不同时间(12h、24h、36h、48h),以及不同浓度的MLT(10~(-6)、10~(-5)、10~(-4)、10~(-3)M)干预24h,HXO-RB_(44)细胞内活性氧的表达情况。 (2)选取HXO-RB_(44)细胞上清液,对体外培养的ARPE-19细胞进行干预,在HXO-RB_(44)细胞上清液干预的ARPE-19细胞内分别加入10~(-9)10~(-7)、10~(-5)M的MLT,利用RT-PCR、免疫荧光细胞化学、Western-blot等方法,分别观察单独用上清液以及上清液+不同浓度的MLT干预后24h ARPE-19细胞内VEGF mRNA及蛋白质的表达情况。 (3)将体外培养的HXO-RB_(44)细胞,分别利用不同浓度的MLT(10~(-10)、10~(-9)、10~(-8)、10~(-7)M)进行干预24h,或利用10~(-7)M的MLT进行干预4h、8h、12h、24h。采用Hoechst荧光染色观察细胞核凋亡的形态学改变;流式细胞仪监测分析细胞周期与凋亡;RT-PCR、免疫细胞化学及Western-blot从mRNA及蛋白水平检测P21、P27基因的变化。 (4)建立50只RB裸鼠皮下移植瘤模型,随机分成5组:低、中、高浓度组分别按每只每次腹腔注射MLT 20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg各2mL进行给药,阴性对照组注射等量生理盐水,阳性对照组每只每次腹腔注射等量VP-16(4mg/kg),每天给药一次,共7次。观察各组裸鼠皮下移植瘤生长情况、裸鼠体重的变化。采用组织病理学检查,观察裸鼠移植瘤的形态学特征;采用免疫组化、Western-blot检测肿瘤细胞VEGF、ICAM-1的表达情况。 结果 (1)浓度为10~(-7)M以下的MLT不能抑制HXO-RB_(44)细胞增殖,浓度为10~(-6)以上的MLT能够显著抑制HXO-RB_(44)细胞增殖,随着作用时间的延长,其抑制效率增强。10~(-5)M的MLT干预后不同时间点,随着干预时间的延长,HXO-RB_(44)细胞内ROS浓度逐渐升高;药物浓度介于10~(-6)M与10~(-4)M之间的MLT,随药物浓度的升高,HXO-RB_(44)细胞内ROS的表达逐渐升高。 (2)HXO-RB_(44)细胞上清液作用后4h、8h、12h、24h,ARPE-19细胞内VEGF mRNA及蛋白质呈高表达。不同浓度的MLT干预24小时,随MLT浓度的增大,各组ARPE-19细胞内VEGF mRNA及蛋白质的表达逐渐降低 (3)不同浓度的褪黑素分别作用于培养的HXO-RB_(44)细胞4h、8h、12h、24h后,细胞核固缩、核碎裂增多;药物干预后,G_0/G_1期细胞明显增多,S期细胞减少,G_2/M期细胞相对增多;各组细胞核内均有P21、P27的表达。与阴性对照组相比,MLT干预组细胞内P21、P27 mRNA及蛋白质的表达增强(P0.01),并具有浓度及时间依赖性。 (4)40mg/kg、60mg/kg的MLT能明显抑制裸鼠移植瘤的生长。低、中、高剂量的MLT治疗组以及阳性对照组,裸鼠移植瘤抑瘤率分别为12.5%、27.89%、40.72%、44.52%。组织病理学检查发现治疗组及阳性对照组移植瘤内出血、坏死的程度明显高于阴性对照组;免疫组化、Western-blot结果显示治疗组VEGF、ICAM-1的表达明显低于对照组。 结论(1)10~(-6)M以上浓度的MLT能够有效地抑制HXO-RB44细胞增殖,其抑制效率随药物浓度的升高和作用时间的延长而增强;MLT的抗细胞增殖作用可能与其诱导HXO-RB_(44)细胞内的活性氧产生有关。 (2)HXO-RB_(44)细胞上清液能促进ARPE-19细胞内VEGF的表达,随干预时间的延长,ARPE-19细胞内VEGF的表达增强。MLT能抑制HXO-RB_(44)细胞上清液诱导的ARPE-19细胞内VEGF的高表达,随着药物浓度的增大,ARPE-19细胞内VEGF表达降低。 (3)褪黑素能够阻滞HXO-RB_(44)细胞周期于G_0/G_1期,促进细胞内P21、P27mRNA及蛋白质的高表达并诱导HXO-RB_(44)细胞凋亡。 (4)MLT对HXO-RB_(44)细胞皮下移植瘤生长有抑制作用,MLT能抑制裸鼠移植瘤内VEGF、ICAM-1蛋白质的表达,其浓度与VEGF、ICAM-1蛋白质的表达呈高度负相关。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R739.7

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【参考文献】
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