脑出血大鼠神经干细胞移植后IL-2、IL-10的表达及中药干预的影响

【摘要】： 研究背景脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是急性脑血管病中的危重类型,脑出血后最初30天的死亡率是43-51%,存活者75%留有不同程度残疾,致使病人生活质量严重下降,同时也给社会、家庭带来了严重的负担。神经干细胞(neural stem cells,NSC)的发现给脑血管疾病的治疗带来新的希望,但由于脑出血后内源性神经干细胞发生的数目有限,不足以修复脑出血后神经损伤,因此用外源性神经干细胞移植治疗脑出血有可能取得满意的效果。然而脑出血后血脑屏障破坏,大量血液细胞侵入脑内,其中免疫细胞激活导致细胞因子释放。这种脑内环境的改变既可促进小胶质细胞等细胞表面表达主要组织相容性复合物(MHC)分子,促进抗原递呈及识别,也可诱导神经干细胞MHC分子的表达,脑内原有的“免疫豁免”环境发生了改变,可诱发免疫排斥反应,加重组织损伤。 根据免疫反应理论,脑出血血脑屏障损伤情况下,用NSC移植治疗可能发生移植物抗宿主反应(GVHD),即以Th1为主,Th2、CTL参与的免疫反应。Th1释放许多细胞因子,如IL-2、IFN-γ等,引起脑组织引起炎症反应。IL-2无论在脑出血的炎症反应或免疫排斥过程中,均起着关键作用。Th2分泌的IL-10、IL-4与免疫移植中免疫耐受有密切关系。 目的:本研究旨在通过观察泻火补肾汤对白介素-2(interleukin 2,IL-2)和白介素-10(interleukin 10、IL-10)在NSC移植后脑出血大鼠脑内表达的影响,探讨泻火补肾汤在NSC移植免疫反应中的作用及可能机制。 方法:1.分离培养初生3-5天SD大鼠海马组织神经干细胞,用nestin抗原免疫细胞化学鉴定,然后进行传代。2.用补体依赖性细胞毒实验方法(CDC)检测SD大鼠的群体反应性抗体(Paner reactiveAntibody,PRA)值,选取致敏、高敏大鼠260只准备进行神经干细胞移植实验;3.260只大鼠随机分为A组(正常组,n=10)、B组(假手术组,n=10)、C组(脑出血组,n=50)、D组(脑出血泻火补肾汤组,n=50)、E组(脑出血NSC移植组,n=50)及F组(脑出血NSC移植加泻火补肾汤组,n=50),Ⅶ型胶原酶注入苍白球复制脑出血模型,术后2d进行NSC移植,第2d、4d、7d、14d、28d分5批处死,取脑组织标本,分别用RT-PCR及免疫组化(SABC)方法检测大鼠脑组织IL-2、IL-10mRNA和蛋白的表达水平。 结果 1.免疫组化 (1)免疫组化检测脑内IL-2蛋白表达:正常组脑组织见阳性细胞少量表达,各组术后2d可见阳性细胞明显增多,4d达到高峰(P＜0.05),其中E组染色阳性细胞最多,7d、14d逐渐减少,28d B、C、D、F组基本回落至正常,但E组与正常组比较仍表达有增高(P＜0.01)。各组各时间点中E组IL-2表达最强(P＜0.05)。同时间点F组比E组、D组比C组IL-2表达减弱(P＜0.05),阳性细胞主要分布于血肿周边组织,根据形态判断主要为少突胶质细胞。 (2)免疫组化检测脑内IL-10蛋白表达:正常脑组织见少量阳性细胞散在分布,各组术后2d可见表达升高,14d时达峰值(P＜0.05),28d时阳性细胞明显减少(P＜0.05)。各组各时间点中F组IL-10表达最强(P＜0.05)。同时间点除28d外,F组比E组、D组比C组IL-10表达增强(P＜0.05)。染色阳性的细胞主要分布于血肿周边组织,根据形态判定主要为纤维性星型胶质胶质细胞。 2.RT-PCR (1)RT-PCR检测脑内IL-2 mRNA表达:正常组IL-2 mRNA仅有极少量表达,2d时B、C、D、E、F五组IL-2 mRNA表达较A组显著升高(P＜0.01),且4d时达到表达高峰(P＜0.05),其中E组表达最强(P＜0.05)。7d、14d时IL-2 mRNA表达逐渐下降(P＜0.05),28d时B、C、D、F 4组基本减少至正常,但E组与正常组比较表达仍有增高(P＜0.05)。同时间点,F组比E组、D组比C组IL-2 mRNA表达明显减弱(P＜0.05)。 (2)RT-PCR检测脑内IL-10 mRNA表达:正常组IL-10 mRNA有少量表达。2d后B、C、D、E、F五组IL-10 mRNA表达较A组升高,其中F组(脑出血神经干细胞移植加泻火补肾汤组)表达最强(P＜0.01),7d逐渐增强(P＜0.05),14d时可见B、C、D、E四组IL-10mRNA表达高峰(P＜0.05),28d B、C、D、E、F五组较14d表达下调。同时间点,F组比E组、D组比C组IL-10 mRNA表达增高(P＜0.05)。 结论 1.脑出血大鼠神经干细胞移植后IL-2表达上调,IL-10表达下调。泻火补肾汤能下调移植后IL—2的表达,上调IL-10的表达。 2.泻火补肾汤对脑出血神经干细胞移植后的免疫排异反应有耐受效果,其机制可能是通过下调IL-2和上调IL-10的表达来实现的。