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《中南大学》 2009年
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Bcl_2下调APE1活性抑制NNK诱导DNA损伤后AP位点的修复

赵劲风  
【摘要】: 目的:脱嘌呤/脱嘧啶位点(AP site)是DNA损伤最常见的形式,通常由碱基切除修复途径修复,而APE1是该修复途径的一个重要成分;Bcl_2是细胞内一重要的肿瘤蛋白,它的致癌活性因抑制多种DNA修复途径引起,包括碱基切除修复途径,Bcl_2能抑制NNK诱导剂的DNA损伤后产生AP位点的修复,但其机理仍不清楚,为了探索Bcl_2抑制DNA损伤AP位点的修复的分子机理,进行Bcl_2与APE1是否直接相互作用的研究。 方法:Western Blotting检测Bcl_2、APE1和XRCC1蛋白的表达情况,单细胞电泳、定量检测AP位点来观察DNA损伤程度,免疫沉淀检测Bcl_2蛋白和APE1蛋白,APE1蛋白和XRCC1蛋白相互作用,免疫荧光染色检测Bcl_2、APE1蛋白的细胞分布情况及其变化,亚细胞结构分离提取蛋白观察Bcl_2蛋白在细胞核及线粒体中表达水平及其变化,APE1核酸内切酶活性测定观察Bcl_2对APE1核酸内切酶活性的影响及其Bcl_2的BH结合域的关系。Bcl_2SiRNA干扰技术观察Bcl_2内源性表达被抑制后对APE1核酸内切酶活性的影响。粒的H1299细胞中AP位点数量也在下降,但比前一组慢,仍维持在较高水平,说明去掉NNK后未转染Bcl_2质粒的H1299细胞中DNA损伤在逐步修复,而转染野生型Bcl_2质粒的H1299细胞中DNA损伤后AP位点的修复受到抑制。NNK处理1小时后两组H1299细胞的细胞核均有拖尾现象,说明NNK可以使H1299细胞中DNA发生损伤;去掉NNK诱导剂后24小时观察发生未转染H1299细胞中DNA的细胞核未有拖尾现象现象,说明DNA损伤已得到修复,但另一组细胞中仍有部分细胞核有拖尾,说明DNA损伤仍有部分未得到修复,再次说明Bcl_2蛋白对NNK诱导的DNA损伤后的修复有抑制作用。 用H_2O_2和NNK诱导DNA损伤后,免疫沉淀可以检测到Bcl_2蛋白,说明Bcl_2蛋白和APE1蛋白可以直接相互作用;免疫荧光染色可以看到红色的Bcl_2蛋白和绿色的APE1蛋白在细胞核中积聚,叠加以后细胞核中出现橙色斑点,说明Bcl_2和APE1蛋白在细胞核中直接相互作用。NNK处理1小时后,H460细胞的细胞核中Bcl_2蛋白开始增加,3小时后达到最高,而线粒体中Bcl_2蛋白没有变化,说明Bcl_2蛋白在DNA损伤诱导下在H460细胞核积聚,核中Bcl_2蛋白的增加并不是从线粒体中转移过来的。 APE1蛋白在所有肺癌细胞中均有较好表达,但内源性Bcl_2蛋白仅在H69和H460肺癌细胞中表达。同位素法检测所有肺癌细胞中APE1的活性,发现H69和H460细胞中APE1活性明显比其它肺癌细胞中APE1活性低,说明有内源性Bcl_2蛋白表达能抑制APE1的活性。用转染野生型Bcl_2和缺失突变型△BH_1、△BH_2、△BH_3、△BH_4质粒的H1299细胞作免疫共沉淀发现仅野生型Bcl_2组能检测到Bcl_2蛋白,而其它缺失突变型组未能检测到Bcl_2蛋白,说明Bcl_2蛋白和APE1蛋白直接相互作用与Bcl_2的四个结合域BH_1、BH_2、BH_3和BH_4都有关。对转染野生型Bcl_2和缺失突变型Bcl_2质粒的H1299细胞中APE1核酸内切酶活性定量检测,发现野生型组APE1核酸内切酶活性低,而缺失突变型各组APE1核酸内切酶活性高;可以推断野生型Bcl_2对APE1蛋白核酸内切酶活性有抑制作用,这种抑制作用与野生型Bcl_2蛋白的四个结合域都有关,Bcl_2蛋白的BH结合域的任一缺失都会导致Bcl_2对APE1蛋白核酸内切酶活性和AP位点修复的抑制能力消失。各组APE1核酸内切酶活性定量检测结果野生型组APE1核酸内切酶活性明显低于缺失突变型各组。将纯化的野生型Bcl_2和BH缺失型△BH_1、△BH_2、△BH_3、△BH_4蛋白进行体外试验,发现结果与体内试验结果一致。将Bcl_2siRNA转染到H460细胞组中发现Bcl_2蛋白表达很低,而对照组Bcl_2蛋白的表达水平未有改变;同位素法检测APE1核酸内切酶活性结果发现Bcl_2siRNA三组APE1核酸内切酶活性升高,从而可以推断Bcl_2蛋白可以抑制APE1核酸内切酶活性。 H1299肺癌细胞和转染野生型Bcl_2质粒的H1299肺癌细胞中APE1和XRCC1两种DNA损伤修复蛋白均有比较高水平的表达,而Bcl_2蛋白仅在转染野生型Bcl_2质粒的H1299细胞中出现;DNA损伤诱导剂NNK处理后,免疫共沉淀试验发现未转染的H1299细胞组中检测XRCC1蛋白,并且NNK处理后XRCC1增多,转染野生型Bcl_2质粒的H1299细胞组中虽然也能检测到XRCC1,并且NNK处理后XRCC1也增多,但明显比前两组少很多,说明Bcl_2蛋白可以干扰APE1和XRCC1DNA修复复合物的形成。将不同浓度的纯化Bcl_2蛋白进行体外试验,发现随着纯化Bcl_2蛋白浓度的升高,检测到的XRCC1越来越少,说明纯化的野生型Bcl_2蛋白体外能够抑制APE1/XRCC1的修复复合物的形成,从而抑制DNA损伤后AP位点的修复。 结论:1.Bcl_2能够抑制NNK和H_2O_2诱导的DNA损伤后产生AP位点的修复。 2.当NNK诱导DNA损伤时细胞核中Bel_2表达水平增加,但不是从线粒体中转移过来的。 3.Bcl_2通过它的结合域与APE1直接相互作用下调APE1活性,有助于延缓DNA修复,造成遗传不稳定和肿瘤发生。 4.Bcl_2蛋白能在体内外离解DNA修复复合物APE1/XRCC1,从而抑制DNA损伤后AP位点的修复。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R346

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