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《中南大学》 2009年
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RNAi技术干扰骨肉瘤细胞Dll4表达抑制侵袭转移和血管生成的体内外实验研究

许自力  
【摘要】: 目的:探讨Dll4在骨肉瘤组织的表达及意义;靶向沉默Dll4的表达对骨肉瘤侵袭转移和血管生成的作用机制。 方法: (1)采用免疫组化的方法检测62例骨肉瘤组织中Dll4蛋白的表达,结合临床病理资料分析,研究Dll4的表达与临床病理特征的关系。 (2)构建全长的逆转录病毒pSUPER-Dll4-siRNA质粒,通过鉴定后,将其稳定转染到PT67细胞培养,获得分泌Dll4蛋白病毒血清,干预沉默人骨肉瘤细胞株SOSP-9607E10中Dll4的表达;干预沉默人微血管内皮细胞系(HMEC-1),体外采用划痕实验、Transwell侵袭实验、血管成管实验、MTT和流式细胞仪检测等方法,研究Dll4调控骨肉瘤细胞分化增殖、骨肉瘤侵袭运动和骨肉瘤血管成管的分子机制验证Dll4调控骨肉瘤血管成管的分子机制导致肿瘤生物学行为的改变。 结果: (1)Notch1、Dll4在骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达 Notch1蛋白的阳性表达主要在肿瘤细胞的细胞质或细胞膜,呈棕黄色,散在分布。62例骨肉瘤中有53例呈阳性表达,阳性率为85.5%(53/62),对照组为21.2%(9/43),两组差异具有显著性(P<0.05)。Dll4蛋白的阳性表达主要在肿瘤细胞的细胞质或细胞膜,部分表达在血管内皮细胞。62例骨肉瘤中有55例呈阳性表达,阳性率为88.7%(54/62),对照组为23.6%(10/43),两者之间差别具有显著性(P<0.05),Notch1和Dll4在骨肉瘤中的表达高于在骨软骨瘤中的表达,提示Notch1和Dll4可能参与了骨肉瘤的发生、发展。 (2).Notch1、Dll4表达及其与骨肉瘤病理临床指标的关系 Notch1与Dll4在骨肉瘤中表达存在正相关关系,相关系数rs为0.842,P=0.027。Notch1及Dll4蛋白表达与骨肉瘤组织分化程度、Ennecking分期和有无转移密切相关(P<0.05),但与肿瘤直径、性别、年龄、ALP(碱性磷酸酶)无关(P>0.05)。 (3)骨肉瘤中Notch1和Dll4表达与MVD表达的关系 Notch1高表达组MVD为35.2±9.3,显著高于低表达组28.3±3.4,此外,Dll4高表达组MVD为36.2±7.2,显著高于低表达组29.5±2.2,差别具有显著性(P<0.05)。骨肉瘤中Notch1和Dll4表达与MVD表达的具有相关性(P<0.05),Notch1及Dll4蛋白高表达可能在骨肉瘤血管生成进程中起重要作用。 (4)Dll4的表达与骨肉瘤的侵袭转移潜能密切相关 Dll4 mRNA和蛋白在SOSP-9607H9及SOSP-9607E10两株细胞中的表达。结果显示:在SOSP-9607H9及SOSP-9607E10两个骨肉瘤细胞株细胞中,Dll4 mRNA和蛋白表达水平分别0.43±0.11 vs0.86±0.09、0.47±0.05vs 0.82±0.08,具有显著性差异(P<0.05)。 (5)逆转录病毒介导的小RNA干扰特异性沉默SOSP-9607E10癌细胞系中Dll4的表达 SOSP-9607E10~(Dll4RNAi+)中Dll4的表达被明显抑制,较对照组而言,其抑制效率超过70%(P<0.05),而作为对照的SOSP-9607E10~(Dll4RNAi-)中Dll4的表达较SOSP-9607E10细胞系无明显变化。以上结果提示本研究中采用逆转录病毒介导的小RNA干扰能够有效特异的沉默SOSP-9607E10骨肉瘤细胞中Dll4的表达。 (6)体外实验中抑制Dll4的表达可以抑制骨肉瘤细胞的侵袭迁移而不影响其增殖和凋亡 SOSP-9607E10~(Dll4RNAi+)较SOSP-9607E10~(Dll4RNAi-)细胞迁移能力明显下降,24小时划痕愈合率分别为62%vs 77%,差异具有显著性意义(P<0.05)。采用Transwell侵袭小室测定法比较SOSP-9607E10~(Dll4RNAi+)和SOSP-9607E10~(Dll4RNAi-)的侵袭能力,结果显示SOSP-9607E10~(Dll4RNAi+)和SOSP-9607E10~(Dll4RNAi-)细胞侵袭能力明显下降,24小时培养后穿过Transwell的每低倍视野细胞数分别为63±11 vs129±13,差异具有显著性意义(P<0.05)。用MTT法比较SOSP-9607E10~(Dll4RNAi+)和SOSP-9607E10~(Dll4RNAi-)的增殖能力,差异不具有显著性意义(P>0.05)。检测SOSP-9607E10~(Dll4RNAi+)和SOSP-9607E10~(Dll4RNAi-)的凋亡情况,两组细胞差异不具有显著性意义(P>0.05)。 (7)体内抑制Dll4的表达可以抑制骨肉瘤细胞的成瘤能力 比较Mice~(Dll4RNAi+)和Mice~(Dll4RNAi-)两组裸鼠模型中SOSP-9607E10原发瘤的大小,结果显示皮下种植45天后SOSP-9607E10原发瘤的大小(cm~3)分别为3.01±0.22和3.45±0.23,差异具有显著性意义(P<0.05),比较Mice~(Dll4RNAi+)和Mice~(Dll4RNAi-)两组裸鼠模型SOSP-9607E10原发瘤中的MVD,结果显示Mice~(Dll4RNAi+)和Mice~(Dll4RNAi-)两组裸鼠模型SOSP-9607E10原发瘤中每高倍镜视野平均MVD值分别为29±2和37±3,差异具有显著性意义(P<0.05)。 (8)体外实验中抑制Dll4的表达可以抑制HMEC-1人微血管内皮细胞的侵袭迁移而不影响其增殖和凋亡 实验组HMEC-1~(Dll4RNAi+)较对照组HMEC-1~(Dll4RNAi-)细胞迁移能力明显下降,24小时划痕愈合率分别为69%vs 92%,差异具有显著性意义(P<0.05)。细胞侵袭能力也明显下降,24小时培养后穿过Transwell的每低倍视野细胞数分别为49±6 vs 70±3,差异具有显著性意义(P<0.05)。MTT法比较HMEC-1~(Dll4RNAi+)较对照组HMEC-1~(Dll4RNAi-)的增殖能力,差异不具有显著性意义(P>0.05)。两组细胞的凋亡差异不具有显著性意义(P>0.05)。 (9)体外实验中抑制Dll4的表达可以抑制HMEC-1人微血管内皮细胞的血管生成 HMEC-1~(Dll4RNAi+)组不能成管;对照组成管指数为2397±726,实验组成管指数为489±215,两组差异具有显著性意义(P<0.05)。三维血管新生模型对照组和实验组中每10个微载体成管数分别为45±9和9±7,差异具有显著性意义(P<0.05),这些结果说明体外抑制Dll4的表达可以抑制HMEC-1人微血管内皮细胞的血管生成。 (10)体内实验中抑制Dll4的表达可以抑制VEGF诱导的血管生成 实验组Matrigel中的新生血管少于对照组,实验组和对照组Matrigel中新生血管总长度分别为23634±6421μm和32145±4314μm,差异具有显著性意义(P<0.05)这说明体内实验中抑制的Dll4表达可以抑制VEGF诱导的新生血管生成。 结论:Dll4在骨肉瘤中的高表达可能参与了骨肉瘤的发生发展,Dll4可能作为预测骨肉瘤不良预后的肿瘤标志物;Dll4可能通过调控血管成管分子机制参与了骨肉瘤的侵袭转移;Dll4可能成为抗骨肉瘤侵袭转移和血管生成的基因治疗新靶点。
【学位授予单位】:中南大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R738.1

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